310 10*1mm સ્ટેનલેસ સ્ટીલ કોઇલ્ડ ટ્યુબિંગ રાસાયણિક ઘટક ,સ્પાઇડ્રોઇનના એન-ટર્મિનલ ડોમેન્સ એમીલોઇડ ફાઇબ્રિલ્સ પર આધારિત હાઇડ્રોજેલ્સ બનાવે છે અને પ્રોટીન સ્થિરીકરણ માટે પ્લેટફોર્મ પૂરું પાડે છે.

Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર.તમે મર્યાદિત CSS સપોર્ટ સાથે બ્રાઉઝર સંસ્કરણનો ઉપયોગ કરી રહ્યાં છો.શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે અપડેટ કરેલ બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરો (અથવા Internet Explorer માં સુસંગતતા મોડને અક્ષમ કરો).વધુમાં, ચાલુ સમર્થનની ખાતરી કરવા માટે, અમે શૈલીઓ અને JavaScript વિના સાઇટ બતાવીએ છીએ.
સ્લાઇડર્સ સ્લાઇડ દીઠ ત્રણ લેખો દર્શાવે છે.સ્લાઇડ્સમાંથી આગળ વધવા માટે પાછળના અને આગળના બટનોનો ઉપયોગ કરો અથવા દરેક સ્લાઇડમાંથી આગળ વધવા માટે અંતે સ્લાઇડ કંટ્રોલર બટનોનો ઉપયોગ કરો.

સ્પષ્ટીકરણ

310 10*1mm સ્ટેનલેસ સ્ટીલ કોઇલ્ડ ટ્યુબિંગ સપ્લાયર્સ

રાસાયણિક રચના

યાંત્રિક ગુણધર્મો

રિકોમ્બિનન્ટ સ્પાઈડર સિલ્ક પ્રોટીન (સ્પાઈડર સિલ્ક પ્રોટીન) પાસે નવા બાયોમટીરિયલ્સના વિકાસમાં ઘણી સંભવિત એપ્લિકેશનો છે, પરંતુ તેમની મલ્ટિમોડલ અને એગ્રિગેશન-પ્રોન પ્રકૃતિ તેમને મેળવવા માટે મુશ્કેલ અને ઉપયોગમાં સરળ બનાવે છે.અહીં અમે જાણ કરીએ છીએ કે પુનઃસંયોજક લઘુચિત્ર સ્પિડ્રોઇન પ્રોટીન અને, અગત્યનું, N-ટર્મિનલ ડોમેન (NT) પોતે જ ઝડપથી 37 °C પર સ્વ-સહાયક અને પારદર્શક હાઇડ્રોજેલ્સ બનાવે છે.એનટી અને ગ્રીન ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન અથવા પ્યુરિન ન્યુક્લિયોસાઇડ ફોસ્ફોરીલેઝ ધરાવતા ફ્યુઝન પ્રોટીન સંપૂર્ણ કાર્યાત્મક ફ્યુઝન પ્રોટીન બનાવે છે.હાઇડ્રોજેલ્સ.અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે રિકોમ્બિનન્ટ NT અને ફ્યુઝન પ્રોટીન ઉચ્ચ અભિવ્યક્તિ ઉપજ પ્રદાન કરે છે અને હાઇડ્રોજેલ્સને આકર્ષક ગુણધર્મો જેમ કે પારદર્શિતા, ક્રોસલિંકિંગ વિના જીલેશન અને ઉચ્ચ ઘનતા પર સક્રિય પ્રોટીનનું સીધુ સ્થિરીકરણ પ્રદાન કરે છે.
કરોળિયામાં રેશમ ગ્રંથીઓના સાત જેટલા જુદા જુદા સેટ હોય છે, જેમાંથી દરેક ચોક્કસ પ્રકારનું રેશમ ઉત્પન્ન કરે છે.તમામ સાત રેશમ પ્રજાતિઓ સ્પાઈડર સિલ્ક પ્રોટીન (સ્પીડ્રોઈન્સ)થી બનેલી છે જે લગભગ 6000 અવશેષો લાંબા છે અને તેમાં ગોળાકાર N- અને C-ટર્મિનલ ડોમેન્સ (NT અને CT) 1,2 દ્વારા ઘેરાયેલો વિશાળ કેન્દ્રીય પુનરાવર્તિત પ્રદેશ છે.રેશમનો સૌથી વધુ અભ્યાસ કરાયેલ પ્રકાર, પ્રાથમિક એમ્પુલા, પ્રાથમિક એમ્પુલા ગ્રંથિ દ્વારા ઉત્પન્ન થાય છે.આ ગ્રંથિમાં, ઉપકલા કોષોનું એક મોનોલેયર સ્પિડ્રોઇન પ્રોટીનનું સંશ્લેષણ કરે છે અને તેમને ગ્રંથિના લ્યુમેનમાં સ્ત્રાવ કરે છે, જ્યાં તેઓ અત્યંત ઊંચી સાંદ્રતા (30-50% w/v)3,4 પર દ્રાવ્ય સ્વરૂપ (ડોપિંગ) માં હાજર હોય છે.ગ્રંથિમાં મુખ્ય એમ્પ્યુલર સ્પિડ્રોઇન પ્રોટીનની સંસ્થા અને રચના અંગે ચર્ચા કરવામાં આવી છે, પરંતુ મોટાભાગના પ્રાયોગિક પુરાવા સામાન્ય રીતે હેલિકલ અને/અથવા રેન્ડમ હેલિકલ કન્ફોર્મેશન અને માઇસેલર અથવા લેમેલર 5,6,7,8,9,10 ની હાજરી સૂચવે છે.જ્યારે પુનરાવર્તિત ડોમેન્સ રેશમ તંતુઓના યાંત્રિક ગુણધર્મોને નિયંત્રિત કરે છે, β-શીટ નેનોક્રિસ્ટલ્સ અને આકારહીન બંધારણો બનાવે છે11,12,13,14,15, અંતિમ ડોમેન્સ રેશમ ગ્રંથિ 16,17,18 સાથે બદલાતી પરિસ્થિતિઓના પ્રતિભાવમાં રેશમ તંતુઓનું નિયમન કરે છે.રેશમની રચનાને નિયંત્રિત કરીને, 19. ટર્મિનલ ડોમેન્સ ઉત્ક્રાંતિપૂર્વક સાચવવામાં આવે છે અને તેમનું કાર્ય તમામ સ્પિડ્રોઇન પ્રોટીન 2,20,21 માટે સામાન્ય હોઈ શકે છે.ગ્રંથિમાંથી પસાર થવા દરમિયાન, spidroin નું pH લગભગ 7.6 થી <5.716 સુધી ઘટે છે અને ધીમે ધીમે સાંકડી થતી નળી દ્વારા હલનચલન દ્વારા મધ્યસ્થી શીયર અને સ્ટ્રેચ સાથે વધે છે.સોલ્યુશનમાં, CT એ α-હેલિકલ રચનાત્મક સમાંતર ડાઇમર17 છે, પરંતુ નીચા pH અને શીયર ફોર્સના પ્રતિભાવમાં, CT β-સ્તરો 16, 17 ખોલે છે અને સ્વિચ કરે છે, સંભવતઃ કન્વર્ટ 16 ના પુનરાવર્તિત પ્રદેશોમાં β-સ્તરોને ટ્રિગર કરે છે. NT એ મોનોમેરિક છે. ગ્રંથિના લ્યુમેનમાં સ્થિતિઓ પ્રતિબિંબિત કરે છે અને સ્પિડ્રોઇનની દ્રાવ્યતામાં મધ્યસ્થી કરે છે, પરંતુ ઘટતા pH પર, સંખ્યાબંધ કાર્બોક્સિલિક એસિડ બાજુની સાંકળોનું પ્રોટોનેશન લગભગ 6.5 ના pKa સાથે NTનું ડાઇમરાઇઝેશન તરફ દોરી જાય છે, ત્યાં NT સ્થિર થાય છે અને મોટા પ્રમાણમાં સ્પિડ્રોઇનને ઠીક કરે છે. જથ્થોનેટવર્ક્સ 16,18.આમ, NT ફિલામેન્ટની રચનામાં મુખ્ય ભૂમિકા ભજવે છે, કોટિંગમાં મોનોમરથી ફાઇબર23,24,25માં ડાઇમરમાં બદલાય છે.તારીખ 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29 સુધી અભ્યાસ કરાયેલ તમામ પરિસ્થિતિઓમાં NT અત્યંત દ્રાવ્ય અને હેલિકલ રહે છે, જેણે હેટરોલોગસ પ્રોટીનના ઉત્પાદન માટે દ્રાવ્યતા-વધારતા લેબલ તરીકે તેના વિકાસને પ્રેરણા આપી હતી.
રિકોમ્બિનન્ટ મિની સ્પાઈડર સિલ્ક પ્રોટીન, જેમાં એક NT, એક શોર્ટ રિપીટ રિજન, એક CT, અને શુદ્ધિકરણ માટે His6 ટેગ (His-NT2RepCT) હોય છે, તે જલીય બફરમાં મૂળ સ્પાઈડર સિલ્ક પ્રોટીન જેટલું દ્રાવ્ય છે અને રેશમ સ્પાઈડરની મૂળ મહત્વની લાક્ષણિકતાઓની નકલ કરે છે. .કવરેજ 25.31.His-NT2RepCT ને બાયોમિમેટિક મશીનનો ઉપયોગ કરીને સતત ફાઇબરમાં ફેરવી શકાય છે જેમાં pH 8 દ્રાવ્ય કોટિંગને pH 525,32,33,34,35 પાણીના સ્નાનમાં બહાર કાઢવામાં આવે છે.E. coli ના બાયોરિએક્ટર આથોને વ્યક્ત કરતી હિઝ-NT2RepCT અને ત્યારબાદની સારવાર પછી શુદ્ધિકરણ પછી >14 g/L ઉપજમાં પરિણમ્યું.ઉચ્ચ ઉપજ, ઉચ્ચ દ્રાવ્યતા અને હિસ-NT2RepCT ની એસિડિક પરિસ્થિતિઓમાં પર્યાપ્ત પ્રતિસાદ એ તમામ NT23, 25, 34 ને આભારી છે.
અહીં અમે 37 °C પર પ્રોટીન સોલ્યુશનનું સેવન કરીને એકલા NT સહિત, રિકોમ્બિનન્ટ સ્પિડ્રોઇન પ્રોટીનમાંથી પારદર્શક હાઇડ્રોજેલ્સની ઝડપી રચનાની જાણ કરીએ છીએ.થિયોફ્લેવિન ટી ફ્લોરોસેન્સ (ThT), ફોરિયર ટ્રાન્સફોર્મ ઇન્ફ્રારેડ સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી (FTIR), ન્યુક્લિયર મેગ્નેટિક રેઝોનન્સ સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી (NMR) અને ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી (TEM) નો ઉપયોગ કરીને, અમે જોયું કે NT અને માઇક્રોસ્પાઇડર પ્રોટીન માળખાકીય રૂપાંતરણમાંથી પસાર થાય છે β-sheets અને amyloid-like fibrils. જ્યારે જેલ્સ રચાય છે.વધુમાં, NT અને ગ્રીન ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન (GFP) અથવા પ્યુરિન ન્યુક્લિયોસાઇડ ફોસ્ફોરીલેઝ (PNP) ના ફ્યુઝન પ્રોટીન સંપૂર્ણ કાર્યાત્મક ફ્યુઝન ટુકડાઓ સાથે હાઇડ્રોજેલ્સ બનાવે છે.હેટરોલોગસ યજમાનોમાં ઉચ્ચ-થ્રુપુટ અભિવ્યક્તિ, શારીરિક પરિસ્થિતિઓ હેઠળ હાઇડ્રોજેલ્સની ઝડપી રચના સાથે, એન્જિનિયર્ડ કાર્યો સાથે હાઇડ્રોજેલ્સના ખર્ચ-અસરકારક ઉત્પાદનની શક્યતા ખોલે છે.
મોટા ભાગના નોંધાયેલા રિકોમ્બિનન્ટ સ્પિડ્રોઇન પ્રોટીનથી વિપરીત, His-NT2RepCT ટ્રિસ-એચસીએલ બફરમાં pH 8 પર સ્થિર છે અને તેને 500 mg/mL સુધી વરસાદ વગર કેન્દ્રિત કરી શકાય છે.તેથી, અમને એ જાણીને આશ્ચર્ય થયું કે આ પ્રોટીન 37°C (ફિગ. 1b-d) પર ઉકાળવામાં આવે ત્યારે ઝડપથી ઓપ્ટીકલી સ્પષ્ટ, સ્વ-સહાયક હાઇડ્રોજેલ્સ બનાવે છે.વધુ અભ્યાસો દર્શાવે છે કે His-NT2RepCT જિલેશન પ્રોટીન સાંદ્રતાની વિશાળ શ્રેણી (10–300 mg/mL) પર થયું હતું અને આ સાંદ્રતા જિલેશન સમય (ફિગ. 1c અને પૂરક ફિગ. 1) સાથે વિપરિત રીતે સંબંધિત હતી.His-NT2RepCT ના કયા ભાગો હાઇડ્રોજેલ રચનાની મધ્યસ્થી કરે છે તે શોધવા માટે, અમે પછી ફ્લાસ્ક ઇન્વર્ઝન એસે (આકૃતિ 1a,b) નો ઉપયોગ કરીને દરેક ડોમેનની વ્યક્તિગત રીતે અને વિવિધ સંયોજનોમાં તપાસ કરી.રિકોમ્બિનન્ટ સ્પિડ્રોઇનના તમામ પરીક્ષણ કરાયેલા અપૂર્ણાંકો 1 કલાક કરતાં ઓછા સમયમાં જેલ (300 mg/mL ની પ્રોટીન સાંદ્રતા પર) બનાવે છે, સિવાય કે અવક્ષેપિત 2Rep (ફિગ. 1b).આ સૂચવે છે કે એકલા NT અને CT, સંયોજનમાં, અથવા પુનરાવર્તિત સાથે સંકળાયેલ, 37°C પર જેલ કરી શકે છે અને His6 ટેગ આ પ્રક્રિયાને કોઈ નોંધપાત્ર હદ સુધી અસર કરતું નથી.સામાન્ય ખ્યાલને જોતાં કે NT એ અત્યંત દ્રાવ્ય અને સ્થિર પ્રોટીન છે, અને રિકોમ્બિનન્ટ સ્પિડ્રોઇન હાઇડ્રોજેલ્સના અગાઉના અહેવાલોએ પુનરાવર્તિત પ્રદેશો અને/અથવા CTsમાં રચનાત્મક ફેરફારો માટે જિલેશન અસરોને આભારી છે, એનટી પોતે કરી શકે છે.જિલેશનની શોધ અનપેક્ષિત હતી.પૂરક કોષ્ટક 1) 37, 38, 39. નોંધપાત્ર રીતે, NT પહેલેથી જ 10 મિનિટની અંદર ≥ 300 mg/mL (ફિગ. 1c) ની સાંદ્રતા પર જેલ થઈ ગયું છે.NT ની વિવિધ સાંદ્રતા સાથે શીશી વ્યુત્ક્રમ પ્રયોગોએ દર્શાવ્યું હતું કે 50 mg/mL પર NT સોલ્યુશન હિઝ-NT2RepCT કરતા વધુ ઝડપથી અનુરૂપ સાંદ્રતા (w/v, આકૃતિ 1c) પર નીકળે છે.
આ કાર્યમાં અભ્યાસ કરાયેલ વિવિધ સ્પિડ્રોઇન રચનાઓની યોજનાકીય રજૂઆત.b વિવિધ રિકોમ્બિનન્ટ સ્પિડ્રોઇન પ્રોટીન (300 mg/mL) માટે 37 °C પર જેલ સમય શીશીને ઊંધી કરીને ચકાસવામાં આવે છે.ઇન્ક્યુબેશન વિના તરત જ સીટી જેલ (<300 mg/mL), 2Rep precipitates (300 mg/mL, 5 mm સ્કેલ).હિસ-NT2RepCT અને NT નો જેલ સમય 37°C પર સૂચવેલ પ્રોટીન સાંદ્રતા પર.d કરોળિયા સાથે હિઝ-NT2RepCT અને NT હાઇડ્રોજેલ્સના ફોટોગ્રાફ્સ અને અનુક્રમે નીચે મુદ્રિત અક્ષર “NT” (બંને 200 mg/mL, સ્કેલ બાર 5 mm).
વિવિધ રિકોમ્બિનન્ટ સ્પિડ્રોઇન પ્રોટીન દ્વારા રચાયેલા હાઇડ્રોજેલ્સનો રંગ થોડો અલગ હોય છે, અને નરી આંખનું અવલોકન પારદર્શિતાની વિવિધ ડિગ્રીઓ દર્શાવે છે (ફિગ. 1b).NT જેલ અપવાદરૂપે સ્પષ્ટ હોય છે જ્યારે અન્ય જેલ્સ અપારદર્શક બને છે.હિઝ-NT2RepCT અને NT જેલ નળાકાર ટ્યુબમાં નાખવામાં આવે છે તે ઘાટમાંથી અકબંધ દૂર કરી શકાય છે (ફિગ. 1d).
ચકાસવા માટે કે કુદરતી સ્પાઈડર સિલ્ક કોટિંગ્સ જેલ પરિસ્થિતિમાં હવે રિકોમ્બિનન્ટ સ્પાઈડરોઈન પ્રોટીનના જલીકરણનું કારણ બને છે કે કેમ, સ્વીડિશ બ્રિજ સ્પાઈડર (લેરીનીઓઈડ્સ સ્કોપેટેરિયસ) ની મોટી એમ્પુલા ગ્રંથિમાંથી કોટિંગ્સ એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા.કોટિંગ્સને 20 mM Tris-HCl બફરમાં 50 mg/mL (માપેલા શુષ્ક વજનના આધારે) પર સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યા હતા, પરંતુ 37 °C (પૂરક આકૃતિ 2a) પર 21 દિવસના સેવન દરમિયાન કોઈ જિલેશન જોવા મળ્યું ન હતું.
આ જેલની માત્રા નક્કી કરવા માટે, રેયોલોજિકલ માપનો ઉપયોગ જીલેશન પ્રક્રિયાનો અભ્યાસ કરવા અને એકંદર યાંત્રિક ગુણધર્મો નક્કી કરવા માટે થઈ શકે છે.ખાસ કરીને, એલિવેટેડ તાપમાને સ્ટોરેજ મોડ્યુલસ (સ્થિતિસ્થાપકતા) પર દેખરેખ રાખવાથી જેલિંગ તાપમાન તેમજ કોટિંગના વિસ્કોએલાસ્ટિક ગુણધર્મો વિશે માહિતી મળી શકે છે.તાપમાન વધારવાના પ્રયોગો (1°C/min 25-45°C પર, કુદરતી સિલ્ક સ્ટોક સોલ્યુશન્સનો ઉપયોગ કરીને અગાઉના અભ્યાસોના આધારે) 40,41 દર્શાવે છે કે હિઝ-NT2RepCT અને NT સોલ્યુશન્સનું સંગ્રહ મોડ્યુલી વધતા તાપમાન સાથે વધ્યું છે.વધારો થયો હતો (ફિગ. 2 અને પૂરક ફિગ. 3).નોંધનીય રીતે, NT મોડ્યુલ His-NT2RepCT ની તુલનામાં નીચા તાપમાને વધવાનું શરૂ કર્યું, જે ઝડપી જેલ સમય સાથે સુસંગત છે જ્યારે NT 37°C (આકૃતિ 1) પર His-NT2RepCT સાથે સીધું ઉકાળવામાં આવ્યું હતું.તાપમાનમાં અનુગામી ઘટાડા પછી, સંગ્રહ મોડ્યુલસ નીચા મૂલ્યો પર પાછો ફર્યો ન હતો અને નુકસાન મોડ્યુલસથી ઉપર રહ્યો હતો (જુઓ પૂરક ફિગ. 3), જે ઉષ્મીય રીતે ઉલટાવી શકાય તેવું સ્થિર જીલેશન સૂચવે છે.જીલેશન પછી, અંતિમ સ્થિતિસ્થાપક મોડ્યુલસ 100-500 mg/mL ની સાંદ્રતામાં His-NT2RepCT હાઇડ્રોજેલ્સ માટે 15 થી 330 kPa સુધીનું હતું, અને NT હાઇડ્રોજેલ્સ (100-500 mg/mL) માટે અંતિમ સ્થિતિસ્થાપક મોડ્યુલસ 02 થી 2 ની રેન્જમાં હતું. kPa (ફિગ. , 2 અને સંપૂર્ણ રેમ્પ ડેટા) જુઓ પૂરક ફિગ. 3).
ધ્રુજારી સાથે His-NT2RepCT (300 mg/mL) અને b NT (300 mg/mL) ના માપ દરમિયાન તાપમાનમાં ફેરફાર.તીરો તાપમાનના વલણને સૂચવે છે, અને સ્ટોરેજ મોડ્યુલ ડેટાનું હળવા શેડિંગ ઉત્પાદક દ્વારા નિર્દિષ્ટ કરતા ઓછા ટોર્ક મૂલ્યો પર પરીક્ષણ દર્શાવે છે, જે વધતા અવાજનું કારણ છે.c એલિવેટેડ તાપમાન (100, 300, અને 500 mg/mL) પછી His-NT2RepCT અને NTનું અંતિમ મોડ્યુલ સંચય.બધા મોડ્યુલ રીડિંગ્સ 0.1 Hz ની આવર્તન પર લેવામાં આવે છે.
જિલેશન સાથે સંકળાયેલ રચનાત્મક ફેરફારોની તપાસ કરવાની સંભવિત પદ્ધતિ તરીકે, અમે 37°C (આકૃતિ 3a,b) પર જિલેશન પહેલા અને પછી His-NT2RepCT અને NT ના FTIR સ્પેક્ટ્રા રેકોર્ડ કર્યા છે.અપેક્ષા મુજબ, His-NT2RepCT અને NT સોલ્યુશનનો સ્પેક્ટ્રા 1645 સેમી-1 પર ઉચ્ચારણ બેન્ડ સાથે α-હેલિક્સ/રેન્ડમ કોઇલ ગૌણ માળખું દર્શાવતા પ્રોટીનને અનુરૂપ છે.બંને હાઇડ્રોજેલ્સ માટે, જીલેશનના પરિણામે મધ્ય I બેન્ડમાં લગભગ 1617 cm-1 અને 1695 cm-1 (ફિગ. 3a, b) બે હાથની રચના થઈ, જે એન્ટિસમાંતર β-શીટ સ્ટ્રક્ચર્સની રચના સૂચવે છે.આ ફેરફારો સંબંધિત સેકન્ડ ડેરિવેટિવ અને ડિફરન્સ જિલેશન સ્પેક્ટ્રા (પૂરક ફિગ. 4b) માં પણ સ્પષ્ટપણે જોઈ શકાય છે.NT β-સ્તરના બે બેન્ડ His-NT2RepCT કરતા વધુ સ્પષ્ટ હતા, જે દર્શાવે છે કે NT હાઈડ્રોજેલમાં β-સ્તર બેન્ડની કુલ સામગ્રી NT2RepCT હાઈડ્રોજેલ કરતા વધારે હતી.
His-NT2RepCT અને b NT (બંને 500 mg/mL) નું FTIR શોષણ સ્પેક્ટ્રા (સોલ્યુશન) પહેલાં અને (જેલ) 37°C પર ઇન્ક્યુબેશન પછી.c પુનઃસસ્પેન્ડેડ 50 mg/ml NT2RepCT જેલ અને d NT ની TEM છબીઓ.સ્કેલ બાર 200 એનએમ.e His-NT2RepCT અને NT હાઇડ્રોજેલ્સનો ફાઇબર વ્યાસ.n = 100 માપેલા ફાઇબ્રિલ્સ, p < 0.0001.ભૂલ બાર પ્રમાણભૂત વિચલન દર્શાવે છે.એરર બારનું કેન્દ્ર સરેરાશ છે.આંકડાકીય પૃથ્થકરણ માટે અનપેયર્ડ ટી-ટેસ્ટ (ટુ-ટેલ્ડ) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.f ધ્રુજારી વિના 37 °C પર વિવિધ રિકોમ્બિનન્ટ સ્પિડ્રોઇન પ્રોટીન (100 mg/mL) નું ThT ફ્લોરોસેન્સ.g NT (100 mg/mL) 0%, 5%, 10% અને 20% બીજ સાથે 100 mg/mL NT જેલમાંથી ઇનોક્યુલેશન પ્રયોગો.
ટ્રાન્સમિશન ઈલેક્ટ્રોન માઈક્રોસ્કોપી (TEM) નો ઉપયોગ કરીને જેલનું વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે હાઈડ્રોજેલમાં એમીલોઈડ જેવા ફાઈબ્રિલ્સ (ફિગ. 3c, 3d)નો સમાવેશ થાય છે.NT-રચિત ફાઈબ્રિલ્સ વિસ્તરેલ (5–12 nm વ્યાસ) અને શાખા વગરના હતા, જ્યારે His-NT2RepCT ફાઈબ્રિલ્સ લંબાઈમાં ટૂંકા અને વ્યાસમાં નોંધપાત્ર રીતે પહોળા હતા (7-16 nm) (ફિગ. 3e).આ પરિણામોએ અમને થિયોફ્લેવિન ટી (ThT) એસેનો ઉપયોગ કરીને ફાઇબ્રોસિસના ગતિશાસ્ત્રને અનુસરવાની મંજૂરી આપી.તમામ રિકોમ્બિનન્ટ સ્પિડ્રોઇન પ્રોટીન માટે, જ્યારે નમૂનાઓ 37 °C (ફિગ. 3f, પૂરક ફિગ. 5a) પર ઉકાળવામાં આવ્યા ત્યારે ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલ વધ્યો.આ તારણ સાથે સુસંગત, જેલિંગ પરિસ્થિતિઓ હેઠળ NT અને His-NT2RepCT ની માઇક્રોસ્કોપિક તપાસમાં ThT-પોઝિટિવ એગ્રીગેટ્સ (પૂરક ફિગ. 5b,c) ના નોંધનીય સ્થાનિક સંચય વિના ThT ફ્લોરોસેન્સમાં સમાન વધારો જોવા મળ્યો.ThT-પોઝિટિવ ફાઈબ્રિલ્સની રચના NT અને His-NTCT ટર્બિડિટી (પૂરક ફિગ. 5d) માં વધારા સાથે ન હતી, જેનો અર્થ છે કે જેલમાં ફાઈબ્રિલ્સનું નેટવર્ક જેલની સ્પષ્ટતા સાથે સમાધાન કર્યા વિના રચી શકે છે.પૂર્વ-રચિત ફાઇબ્રિલ્સની થોડી માત્રા ઉમેરીને બીજ વાવવાથી કેટલાક એમીલોઇડ્સ 42,43,44 ની ફાઇબ્રિલ રચનાને નોંધપાત્ર રીતે વેગ મળે છે પરંતુ NT હાઇડ્રોકોએગ્યુલન્ટ્સના દ્રાવણમાં 5%, 10% અથવા 20% (w/w) NT ઉમેરીને.સીડીંગ અસર (ફિગ. 3 જી).કદાચ આ એ હકીકતને કારણે છે કે હાઇડ્રોજેલમાં ફાઇબ્રિલ્સ પ્રમાણમાં નિશ્ચિત છે અને તેનો બીજ તરીકે ઉપયોગ કરી શકાતો નથી.
ઉચ્ચ તાપમાને રિકોમ્બિનન્ટ સ્પિડ્રોઇન પ્રોટીનની અણધારી વર્તણૂક જેલની રચના સાથે સંકળાયેલ રચનાત્મક ફેરફારોને ઓળખવા માટે વધુ ન્યુક્લિયર મેગ્નેટિક રેઝોનન્સ (NMR) સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી અભ્યાસો માટે પ્રોત્સાહિત કરે છે.37°C પર સમય જતાં નોંધાયેલા His-NT2RepCT સોલ્યુશન્સના NMR સ્પેક્ટ્રાએ દર્શાવ્યું હતું કે CT હજુ પણ આંશિક રીતે ફોલ્ડ કરવામાં આવ્યું હતું, જ્યારે NT અને 2Rep સિગ્નલો અદૃશ્ય થઈ ગયા હતા (ફિગ. 4a), સૂચવે છે કે તે મુખ્યત્વે NT અને 2Rep હતા જે હિસ-ની આંશિક રીતે નિયંત્રિત રચના કરે છે. NT2RepCT હાઇડ્રોજેલ.સીટી સિગ્નલને તેની મૂળ તીવ્રતાના 20% સુધી પણ ઘટાડવામાં આવ્યું હતું, જે સૂચવે છે કે સીટી પણ મોટે ભાગે નિશ્ચિત છે અને હાઇડ્રોજેલ માળખામાં સમાવિષ્ટ છે.સીટીના નાના ભાગ માટે, જે પ્રિ-ઇન્ક્યુબેટેડ સેમ્પલ જેટલું જ મોબાઈલ છે અને આ રીતે સોલ્યુશન NMR દ્વારા અવલોકન કરવામાં આવ્યું છે, સ્પેક્ટ્રામાં પ્રથમ 10 માળખાગત અવશેષો માટે સંકેતોનો અભાવ છે, સંભવતઃ His-NT2Rep ના જોડાયેલ ભાગના મુશ્કેલ સ્થિરતાને કારણે.હાઇડ્રોજેલ્સ -NT2RepCT ના -સ્ટેટના એનએમઆર સ્પેક્ટ્રાએ α-હેલીસીસ અને β-સ્તરોની મુખ્ય હાજરી અને ઓછા અંશે, રેન્ડમ કોઇલ કન્ફોર્મેશન (ફિગ. 4b) દર્શાવ્યું હતું.માત્ર NT માં હાજર મેથિઓનાઇન અવશેષોના રાસાયણિક શિફ્ટ વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે આ ડોમેન β-શીટ સ્ટ્રક્ચરમાં રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યું હતું.સોલ્યુશનમાં NT ના સમય-આધારિત સ્પેક્ટ્રાએ સિગ્નલની તીવ્રતા (ફિગ. 4c) માં સમાન ઘટાડો દર્શાવ્યો હતો, અને NT હાઇડ્રોજેલ્સના ઘન-સ્થિતિ NMR એ દર્શાવ્યું હતું કે મોટાભાગના NT અવશેષો β-શીટ સ્ટ્રક્ચર્સ (ફિગ. 4d) માં રૂપાંતરિત થયા હતા.2Rep ની રચના તેની એકંદર કરવાની વૃત્તિને કારણે અલગથી નક્કી કરી શકાતી નથી.જો કે, NTCT અને His-NT2RepCT હાઇડ્રોજેલના ઘન રાજ્ય NMR સ્પેક્ટ્રા ખૂબ સમાન દેખાતા હતા (ફિગ. 4b; પૂરક ફિગ. 6b), જે સૂચવે છે કે 2Rep એ His-NT2RepCT હાઇડ્રોજેલના માળખાકીય ભાગમાં થોડો ફાળો આપ્યો છે.સીટી હાઇડ્રોજેલ્સ માટે, α-હેલિસિસ, β-શીટ્સ અને રેન્ડમ હેલિકલ સેકન્ડરી સ્ટ્રક્ચર્સ અસ્તિત્વમાં હોવાનું જણાયું હતું (પૂરક ફિગ. 6d).આ સૂચવે છે કે સીટીના કેટલાક ભાગો α-હેલીસ રહે છે જ્યારે અન્ય β-શીટ્સ બને છે.આમ, NMR સ્પેક્ટ્રોસ્કોપીના પરિણામો સૂચવે છે કે NT હાઇડ્રોજેલ રચના માટે મહત્વપૂર્ણ છે અને તે 2Rep અને CT સાથે ફ્યુઝન પર β-શીટ કન્ફોર્મેશનમાં પણ પરિવર્તિત થાય છે.આની સાથે સુસંગત, અમે તાજેતરમાં શોધી કાઢ્યું છે કે એમીલોઇડ અવકાશી ઝિપર્સ એનટી ડોમેનના તમામ પાંચ હેલિકોસમાં રચાય છે, અને વોલ્ટ્ઝ અલ્ગોરિધમે હેલિક્સ 1 (ફિગ. 4e) માં એમાયલોઇડોજેનિક પ્રદેશની આગાહી કરી છે.
15N-HSQC નું 2D સ્પેક્ટ્રા 10 mg/mL His-NT2RepCT સોલ્યુશન પહેલા (વાદળી) અને 37°C તાપમાને ઇન્ક્યુબેશન (લાલ) પછી 19 કલાક.લાલ સ્પેક્ટ્રમમાં વ્યક્તિગત ક્રોસ શિખરો અને વાદળી સ્પેક્ટ્રમમાં F24, G136, polyA એક અક્ષર એમિનો એસિડ પ્રતીકો અને અવશેષ નંબરો દ્વારા સૂચવવામાં આવે છે.ઇન્સેટ્સ NT, 2Rep, અને CT ડોમેન્સમાંથી પસંદ કરેલા અવશેષો માટે સમયસર સિગ્નલની તીવ્રતાની અવલંબન દર્શાવે છે.b His-NT2RepCT હાઇડ્રોજેલ્સનું સોલિડ-સ્ટેટ રેડિયો ફ્રીક્વન્સી (RFDR) સ્પેક્ટ્રા.RFDR સ્પેક્ટ્રામાં અવલોકન કરાયેલ Cα/Cβ અવશેષોના સહસંબંધો મોડેલ પેપ્ટાઇડ રાસાયણિક પાળી અને આંકડા 82,83 અને તેમની ગૌણ રચનાઓમાંથી મેળવેલા મૂલ્યો સાથે સરખામણી કરીને નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા.SSB - ફરતી સાઇડબેન્ડ.c 15N-HSQC 10 mg/mL NT સોલ્યુશનનું એક-પરિમાણીય સ્પેક્ટ્રા 36 કલાક માટે 37 °C પર સેવન દરમિયાન.ઇનસેટ સમય વિરુદ્ધ વોલ્યુમેટ્રિક તીવ્રતા દર્શાવે છે.d NT હાઇડ્રોજેલ્સનું સોલિડ સ્ટેટ RFDR સ્પેક્ટ્રા.Cα/Cβ અવશેષો અને RFDR સ્પેક્ટ્રામાં અવલોકન કરાયેલ તેમની ગૌણ રચનાઓનો સહસંબંધ દર્શાવેલ છે.e Zipper ડેટાબેઝ (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/)માંથી NT45.79 ફાઇબરિલેશન પ્રોપેન્સિટી પ્રોફાઇલ પર આધારિત.હેક્સાપેપ્ટાઈડની અવકાશી લાઈટનિંગ શિફ્ટ વિન્ડોની રોસેટા ઉર્જા kcal/mol માં બતાવવામાં આવે છે.લાલ પટ્ટીઓ ઉચ્ચ ફાઇબ્રોસિસ પ્રવૃતિ સાથે હેક્સાપેપ્ટાઇડ્સ દર્શાવે છે (-23 kcal/mol નીચે રોસેટા ઊર્જા; ડોટેડ લાઇનની નીચે).લીલા પટ્ટીઓ થ્રેશોલ્ડની ઉપર રોસેટા ઊર્જા સાથેના ટુકડા સૂચવે છે અને તેથી સ્ટીરિક ઝિપર્સ બનાવવાની શક્યતા ઓછી છે.પ્રોલાઇન ધરાવતા ટુકડાઓ વિશ્લેષણમાંથી બાકાત રાખવામાં આવ્યા હતા (સ્તંભો વિના).સ્ક્વેર્સ વોલ્ટ્ઝ અલ્ગોરિધમ81 (https://waltz.switchlab.org) દ્વારા અનુમાનિત એમાયલોઇડિસના વિસ્તારો દર્શાવે છે.NT ના એમિનો એસિડ અવશેષોનો ક્રમ ટોચ પર છે, અને β ગૌણ માળખું (સોલિડ-સ્ટેટ NMR સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી દ્વારા નિર્ધારિત) માં જોવા મળતા અવશેષોના પ્રકારો લાલ રંગમાં દર્શાવવામાં આવ્યા છે.પાંચ NT α-હેલિસિસની સ્થિતિ (H1-H5)28 તરીકે નિયુક્ત કરવામાં આવી છે.
pH <6.5 પર, HT ડાઇમરાઇઝ થાય છે, જે ગરમી- અથવા યુરિયા-પ્રેરિત વિકૃતિકરણ18 સામે પ્રતિરોધક છે.NT ડાઇમરાઇઝેશન અને સ્થિરતા જિલેશનને કેવી રીતે અસર કરે છે તે સ્પષ્ટ કરવા માટે, 100 mg/ml NT ધરાવતાં ઉકેલોને pH 8, 7 અને 6 પર શીશી વ્યુત્ક્રમ પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીને નિયંત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા.NT સેમ્પલ pH 8 અને 7 પર 30 મિનિટ પછી 37 °C પર ઉકાળવામાં આવ્યા, પરંતુ pH 8 જેલ સ્પષ્ટ રહ્યું, જ્યારે pH 7 જેલ દૃશ્યમાન અવક્ષેપ (ફિગ. 5a) દર્શાવે છે.તેનાથી વિપરિત, pH 6 પર HT ધરાવતું સોલ્યુશન જેલ બનાવતું ન હતું, અને 37°C પર 20 મિનિટ પછી એક મોટો અવક્ષેપ જોઈ શકાય છે.આ સૂચવે છે કે મોનોમર્સની તુલનામાં ડાઇમર્સ પોતે અને/અથવા તેમની ઉચ્ચ સ્થિરતા જિલેશનને અટકાવે છે.પીએચ 7 અને 6 પર NT માટે અવક્ષેપની રચના અપેક્ષિત ન હતી, કારણ કે એવું નોંધવામાં આવ્યું છે કે NT 200 mg/ml27 પર દ્રાવ્ય છે, ગરમીના વિકૃતિકરણ પછી સરળતાથી ફરી વળે છે, અને α-હેલિક્સ પણ જાળવી રાખે છે pH 18. આ વિસંગતતાઓ માટે સંભવિત સમજૂતી એ છે કે અગાઉ નોંધાયેલા પ્રયોગો ઓરડાના તાપમાને અથવા તેનાથી નીચે, અથવા પ્રમાણમાં ઓછી પ્રોટીન સાંદ્રતા 16,18,19 પર હાથ ધરવામાં આવ્યા હતા.
NT શીશી વ્યુત્ક્રમ પરીક્ષણ (100 mg/mL) pH 8, 7, 6 અને 154 mM NaCl (pH 8) પર 37°C પર સેવન પછી.b અનુક્રમે 154 mM NaF અને 154 mM NaCl સાથે અને વગર NT CD સ્પેક્ટ્રા.222 nm પર દાઢની લંબગોળતા કુદરતી ગણોના પ્રમાણમાં રૂપાંતરિત થાય છે.c NT ઇન્વર્ઝન એસે (100 mg/mL) NT* (37 °C અને 60 °C), NTA72R (37 °C), અને His-NT-L6 (37 °C અને 60 °C).d NT મ્યુટન્ટ્સ NT*, NTA72R, અને His-NT-L6 નો CD સ્પેક્ટ્રા.222 nm પર દાઢની લંબગોળતા કુદરતી ગણોના પ્રમાણમાં રૂપાંતરિત થાય છે.NTFlSp, NTMiSp અને ઘટાડેલ NTMiSp (100 mg/mL) નું વ્યુત્ક્રમ પરીક્ષણ.સ્કેલ બાર 5 મીમી.f NT, NTFlSp, NTMiSp અને ઘટાડેલ NTMiSp ના CD સ્પેક્ટ્રા.222 nm પર દાઢની લંબગોળતા કુદરતી ગણોના પ્રમાણમાં રૂપાંતરિત થાય છે.પૂરક આકૃતિ 8 માં 25 °C અને 95 °C પર પૂર્ણ NT સ્પેક્ટ્રા બતાવવામાં આવ્યું છે.
શારીરિક મીઠાની સાંદ્રતા NT સબ્યુનિટ્સ વચ્ચે ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ અને નીચલા pH18 પર NT ટ્રાન્સફરનું ડાયમરાઇઝેશન નક્કી કરે છે.અમે શોધી કાઢ્યું કે 154 mM NaCl અને NaF ની હાજરી ખરેખર અનુક્રમે જીલેશનને અટકાવે છે (ફિગ. 5a, b; પૂરક ફિગ. 2b) અને આ ક્ષારોએ NT મોનોમર્સની થર્મલ સ્થિરતામાં વધારો કર્યો છે (ફિગ. 5b, પૂરક ફિગ. 8) .તે એ પણ સૂચવે છે કે સ્થિરતા વૃદ્ધિ, ડાઇમરાઇઝેશનને બદલે, જેલની રચનાને અટકાવે છે.
જીલેશનમાં પ્રોટીન ડાઇમરાઇઝેશન અને સ્થિરતાની ભૂમિકાનું વધુ અન્વેષણ કરવા માટે, અમે બે મ્યુટન્ટ્સનો ઉપયોગ કર્યો, NT* અને NTA72R, જે નીચા pH28.30 પર પણ મોનોમેરિક રહે છે.NT* એ ડબલ ચાર્જ રિવર્સલ મ્યુટન્ટ છે જેમાં મોનોમરનું દેખીતું દ્વિધ્રુવી ચાર્જ વિતરણ સપાટ થાય છે, જે ડાઇમરાઇઝેશનને અટકાવે છે અને મોનોમર સ્થિરતામાં ભારે વધારો કરે છે.NTA72R એ ચાર્જ થયેલ દ્વિધ્રુવ છે, પરંતુ આર્ગ-અવેજીકૃત અલા ડાઇમર સીમા પર સ્થિત છે, તેથી પરિવર્તન ડાયમરાઇઝેશન માટે જરૂરી સબયુનિટ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓમાં દખલ કરે છે.37°C પર ઉકાળવા પર, NT* એ હાઇડ્રોજેલ બનાવ્યું ન હતું, જ્યારે NTA72R એ 15 મિનિટ (ફિગ. 5c) માટે અપારદર્શક જેલની રચના કરી હતી.કારણ કે NT* અને NTA72R બંને ડાઇમરાઇઝ કરી શકતા નથી પરંતુ મોનોમર સ્ટેબિલિટી (ફિગ. 5d) માં ભિન્ન છે, આ પરિણામો ભારપૂર્વક સૂચવે છે કે ઉચ્ચ થર્મોડાયનેમિક સ્થિરતા NT ને જેલિંગથી અટકાવે છે.આને એ હકીકત દ્વારા પણ સમર્થન મળે છે કે HT* જ્યારે ઊંચા તાપમાને અસ્થિર હોય ત્યારે જેલ બનાવે છે (60°C પર 8 મિનિટ પછી; Fig. 5c).અગાઉ એવું દર્શાવવામાં આવ્યું છે કે NT માં મેથિઓનાઇનની ઉચ્ચ સામગ્રી તેના કુદરતી ફોલ્ડિંગને પ્રવાહી બનાવે છે અને છ મેટ ટુ લ્યુ અવેજી (અહીં હિઝ-એનટી-એલ6 તરીકે ઓળખાય છે) NT46 મોનોમરને મજબૂત રીતે સ્થિર કરે છે.NT જેલની રચના માટે માળખાકીય સુગમતા જરૂરી છે તેવી ધારણાના આધારે, અમે જોયું કે His-NT-L6 સ્થિર મ્યુટન્ટ 37 °C (આકૃતિ 5c, d) પર જેલ કરતું નથી.જો કે, His-NT-L6 એ 60 મિનિટ (ફિગ. 5c) માટે 60°С પર ઉકાળવા પર એક જેલની રચના પણ કરી.
NT ની β-શીટ સ્ટ્રક્ચર્સમાં રૂપાંતરિત થવાની અને હાઇડ્રોજેલ્સ બનાવવાની ક્ષમતા કેટલાકને લાગુ પડે છે પરંતુ તમામ NT ડોમેન્સ સ્પિડ્રોઇનને લાગુ પડતી નથી.વિવિધ રેશમ પ્રકારો અને કરોળિયાની પ્રજાતિઓમાંથી NTs, Trichonephila clavipes (NTFlSp), તેમની પ્રમાણમાં ઓછી મેથિઓનાઇન સામગ્રી અને ઉચ્ચ થર્મલ સ્થિરતા (ફિગ. 5e, f અને પૂરક કોષ્ટક 2) હોવા છતાં જેલ બનાવે છે.તેનાથી વિપરીત, ઓછી થર્મલ સ્થિરતા અને ઉચ્ચ મેથિઓનાઇન સામગ્રી સાથે એરેનિયસ વેન્ટ્રિકોસસ (NTMiSp) ના નાના એમ્પ્યુલર પ્રોટીન સ્પિડ્રોઇનમાંથી NT એ હાઇડ્રોજેલ્સ (પૂરક કોષ્ટક 2 અને ફિગ. 5e, એફ) બનાવ્યું ન હતું.બાદમાં ઇન્ટ્રામોલેક્યુલર ડાયસલ્ફાઇડ બોન્ડ 29,47ની હાજરી સાથે સંકળાયેલ હોઈ શકે છે.સતત, જ્યારે NTMiSp ના ડિસલ્ફાઇડ બોન્ડમાં ઘટાડો કરવામાં આવ્યો હતો, ત્યારે તે 10 મિનિટ (ફિગ. 5e) માટે 37°C પર ઉકાળો પછી હાઇડ્રોજેલ બનાવે છે.નિષ્કર્ષમાં, એ નોંધવું જોઈએ કે એનટીમાંથી જેલની રચના માટે માળખાકીય સુગમતા એ મહત્વપૂર્ણ છે, પરંતુ એકમાત્ર માપદંડ નથી.અન્ય પરિબળ જે સુસંગત હોઈ શકે છે તે છે એમીલોઈડ ફાઈબ્રીલ્સ બનાવવાની વૃત્તિ, અને ઝિપર ડેટાબેઝ અને વોલ્ટ્ઝ અલ્ગોરિધમ સાથેના વિશ્લેષણમાં જેલ બનાવવાની ક્ષમતા અને એમીલોઈડોજેનિક પ્રદેશોની હાજરી, તેમજ અનુમાનિત વિસ્તારોની હદ વચ્ચેનો સંબંધ દર્શાવવામાં આવ્યો હતો. સ્ટીરિક ઝિપર્સ બનાવવા માટે.એક સહસંબંધ હતો (પૂરક કોષ્ટક 2 અને પૂરક ફિગ. 9).
અનુકુળ પરિસ્થિતિઓમાં ફાઇબ્રીલ્સ અને જેલ્સ બનાવવાની એનટીની ક્ષમતાએ અમને એવી ધારણા કરવા તરફ દોરી કે અન્ય પ્રોટીન ટુકડાઓ સાથે એનટી ફ્યુઝન હજુ પણ ફ્યુઝન ભાગીદારોના સંપૂર્ણ કાર્ય સાથે જેલ બનાવી શકે છે.આને ચકાસવા માટે, અમે NT ના C-ટર્મિનસ પર અનુક્રમે ગ્રીન ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન (GFP) અને પ્યુરિન ન્યુક્લિયોસાઇડ ફોસ્ફોરીલેઝ (PNP) રજૂ કર્યા.પરિણામી ફ્યુઝન પ્રોટીન ખૂબ જ ઊંચી અંતિમ ઉપજ સાથે E. coli માં વ્યક્ત કરવામાં આવ્યા હતા (હિઝ-NT-GFP અને His-NT-PNP માટે અનુક્રમે 150 mg/L અને 256 mg/L શેક ફ્લાસ્ક કલ્ચર), જે દર્શાવવામાં આવ્યું છે તેની સાથે સુસંગત છે. એનટી રેફ સાથે જોડાયેલા અન્ય પ્રોટીન માટે.30. His-NT-GFP (300mg/mL) અને His-NT-PNP (100mg/mL) ફ્યુઝન પ્રોટીન 2 કલાક અને 6.5 કલાક પછી 37°C તાપમાને જેલ બનાવે છે અને અગત્યનું, GFP અપૂર્ણાંક યથાવત રહ્યો.જીલેશન પછી અવલોકન કરવામાં આવે છે, જેલેશન પછી પ્રારંભિક ફ્લોરોસેન્સ તીવ્રતાના >70% બાકી રહે છે (ફિગ. 6a).તેના-NT-PNP સોલ્યુશન્સ અને જેલ્સમાં PNP પ્રવૃત્તિને માપવા માટે, અમારે NT સાથે ફ્યુઝન પ્રોટીનને પાતળું કરવું પડ્યું કારણ કે શુદ્ધ તૈયારીની એન્ઝાઇમેટિક પ્રવૃત્તિ જેલિંગ સાંદ્રતા પર પરખની શોધ શ્રેણીની બહાર હતી.0.01 mg/mL His-NT-PNP અને 100 mg/mL NT ધરાવતા મિશ્રણ સાથે બનેલી જેલ પ્રિ-ઇન્ક્યુબેટેડ નમૂનાઓની પ્રારંભિક એન્ઝાઈમેટિક પ્રવૃત્તિના 65% જાળવી રાખે છે (ફિગ. 6b).માપન દરમિયાન જેલ અકબંધ રહી (પૂરક ફિગ. 10).
હિઝ-એનટી-જીએફપી (300 એમજી/એમએલ) ના જલીકરણ પહેલા અને પછી સંબંધિત ફ્લોરોસેન્સ તીવ્રતા અને દૃશ્યમાન અને યુવી પ્રકાશ હેઠળ હિસ-એનટી-જીએફપી હાઇડ્રોજેલ (300 એમજી/એમએલ) ધરાવતી ઊંધી શીશી.પોઈન્ટ વ્યક્તિગત માપ દર્શાવે છે (n = 3), ભૂલ બાર પ્રમાણભૂત વિચલન દર્શાવે છે.સરેરાશ મૂલ્ય ભૂલ બારની મધ્યમાં બતાવવામાં આવે છે.b PNP પ્રવૃત્તિ NT (100 mg/ml) અને 0.01 mg/ml his-NT-PNP અને 100 mg/ml ન્યૂ તાઇવાન ડૉલર ધરાવતાં સોલ્યુશન અને જેલ્સનો ઉપયોગ કરીને ફ્લોરોમેટ્રિક વિશ્લેષણ દ્વારા મેળવવામાં આવી હતી.ઇનસેટ હાઈડ્રોજેલ ધરાવતી ઊંધી શીશી બતાવે છે જેમાં His-NT-PNP (5 mm સ્કેલ બાર) હોય છે.
અહીં, અમે 37°C (આકૃતિ 1) પર પ્રોટીન સોલ્યુશન ઉકાળીને એનટી અને અન્ય રિકોમ્બિનન્ટ સ્પાઇડ્રોઇન પ્રોટીનમાંથી હાઇડ્રોજેલ્સની રચનાની જાણ કરીએ છીએ.અમે બતાવીએ છીએ કે જીલેશન α-હેલીસીસના β-સ્તરોમાં રૂપાંતર અને એમીલોઇડ જેવા ફાઈબ્રિલ્સ (ફિગ. 3 અને 4) ની રચના સાથે સંકળાયેલું છે.આ શોધ આશ્ચર્યજનક છે કારણ કે NTs કોઇલ કરેલ ગ્લોબ્યુલર ફાઇવ-હેલિક્સ બંડલ છે જે તેમની અત્યંત ઊંચી દ્રાવ્યતા અને ઉચ્ચ સ્થિરતા માટે 200 mg/mL 4°C પર કેટલાક દિવસો માટે જાણીતું છે.વધુમાં, µM માં ઓછી પ્રોટીન સાંદ્રતા પર ગરમીના વિકૃતિકરણ પછી NTs સરળતાથી ફરીથી ફોલ્ડ થાય છે.અમારા પરિણામો અનુસાર, ફાઈબ્રિલની રચના માટે >10 mg/mL પ્રોટીન સાંદ્રતા અને સહેજ ઉન્નત તાપમાન (ફિગ. 1) નું સંયોજન જરૂરી છે.આ એ વિચાર સાથે સુસંગત છે કે એમીલોઈડ ફાઈબ્રિલ્સ ગ્લોબ્યુલર રીતે ફોલ્ડ પ્રોટીનમાંથી રચના કરી શકે છે જે શારીરિક પરિસ્થિતિઓમાં થર્મલ વધઘટને કારણે આંશિક રીતે ખુલ્લી સ્થિતિમાં હોય છે 48.આ રૂપાંતરણમાંથી પસાર થતા પ્રોટીનના ઉદાહરણોમાં ઇન્સ્યુલિન 49,50, β2-માઇક્રોગ્લોબ્યુલિન, ટ્રાન્સથાઇરેટિન અને લાઇસોઝાઇમ 51,52,53નો સમાવેશ થાય છે.NT તેની મૂળ સ્થિતિમાં α-હેલિક્સ હોવા છતાં, લગભગ 65% પોલિપેપ્ટાઇડ સાંકળ સ્ટેરિક ઝિપર રચના (ફિગ. 4e) 45 સાથે સુસંગત છે.મોનોમર ગતિશીલ રીતે મોબાઈલ 46 હોવાથી, તે આ સંભવિત એમાયલોઇડોજેનિક વિસ્તારોને સાધારણ ઊંચા તાપમાને ઉજાગર કરી શકે છે અને કુલ પ્રોટીનની ઊંચી સાંદ્રતા પર એમીલોઈડ ફાઈબ્રિલ રચના54 માટે નિર્ણાયક સાંદ્રતા સુધી પહોંચી શકે છે.આ તર્કને પગલે, અમને સ્પિડ્રોઇન સાંદ્રતા અને જલીકરણ સમય (ફિગ. 1c) વચ્ચે નકારાત્મક સંબંધ જોવા મળ્યો, અને જો મોનોમેરિક NT કન્ફોર્મેશન કાં તો પરિવર્તન (NT*, His-NT-L6) દ્વારા અથવા મીઠાના ઉમેરા દ્વારા સ્થિર થાય છે, તે અટકાવી શકે છે. રચના હાઇડ્રોજેલ્સ (ફિગ. 5).
મોટાભાગના કિસ્સાઓમાં, એમીલોઇડ ફાઇબ્રીલ્સ દ્રાવણમાંથી અવક્ષેપ તરીકે અદૃશ્ય થઈ જાય છે, પરંતુ અમુક પરિસ્થિતિઓમાં તેઓ હાઇડ્રોજેલ્સ 55,56,57 બનાવી શકે છે.હાઇડ્રોજેલ-રચના ફાઇબ્રીલ્સ સામાન્ય રીતે ઉચ્ચ પાસા ગુણોત્તર ધરાવે છે અને પરમાણુ ગૂંચવણ દ્વારા સ્થિર ત્રિ-પરિમાણીય નેટવર્ક બનાવે છે, 55,58 અમારા પરિણામો સાથે સુસંગત છે.વિટ્રોમાં હાઇડ્રોજેલ રચના માટે, પ્રોટીન ઘણીવાર સંપૂર્ણ અથવા આંશિક રીતે પ્રગટ થાય છે, ઉદાહરણ તરીકે, કાર્બનિક દ્રાવકોના સંપર્કમાં, ઉચ્ચ તાપમાન (70–90°C) અને/અથવા નીચા pH (1.5–3.0)59,60,61,62.અહીં વર્ણવેલ સ્પિડ્રોઇન હાઇડ્રોજેલ્સને કઠોર પ્રક્રિયાની જરૂર હોતી નથી, ન તો હાઇડ્રોજેલ્સને સ્થિર કરવા માટે ક્રોસ-લિંકિંગ એજન્ટોની જરૂર પડે છે.
અગાઉ એવું નોંધવામાં આવ્યું છે કે સ્પિડ્રોઇન રિપીટ થાય છે અને QD, જે સિલ્ક સ્પિનિંગ દરમિયાન β-શીટ સ્વિચિંગમાંથી પસાર થાય છે, તે હાઇડ્રોજેલ્સ બનાવે છે.અમારા તારણોની તુલનામાં, ઉષ્ણતામાન સમય અને/અથવા સેવનનું તાપમાન અનુક્રમે નોંધપાત્ર રીતે લાંબું અથવા ઊંચું હતું, અને પરિણામી હાઇડ્રોજેલ્સ ઘણીવાર અપારદર્શક હતા (આકૃતિ 7 અને પૂરક કોષ્ટક 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. ઝડપી જેલ સમય ઉપરાંત, NT હાઇડ્રોજેલ્સ >300 mg/mL (30%) એ અન્ય તમામ વર્ણવેલ રિકોમ્બિનન્ટ સ્પાઈડર સિલ્ક પ્રોટીન હાઈડ્રોજેલ્સ, તેમજ કુદરતી હાઈડ્રોજેલ્સ જેમ કે જિલેટીન, અલ્જીનેટ (2%), અગર (0.5%) કરતાં વધુ પ્રદર્શન કર્યું. ) અને કોલેજન.(0.6%) (આકૃતિ 7 અને પૂરક કોષ્ટકો 1 અને 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
આ અભ્યાસમાં હાઇડ્રોજેલ્સના જેલ સમય અને સ્થિતિસ્થાપક મોડ્યુલસની સરખામણી અન્ય સ્પાઇડ્રોઇન-આધારિત હાઇડ્રોજેલ્સ અને પસંદ કરેલા કુદરતી હાઇડ્રોજેલ્સ સાથે કરવામાં આવી હતી.સંદર્ભો જેલેશન શરતોના વર્ણન સાથે આપવામાં આવે છે.APS એમોનિયમ પર્સલ્ફેટ, ઓરડાના તાપમાને.ડેટા 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
કરોળિયાએ સ્ટોરેજ દરમિયાન સ્પાઇડરોઇનને જેલિંગ કરતા અટકાવવાની રીતો વિકસાવી હોવાનું જણાય છે.રેશમ ગ્રંથિમાં પ્રોટીનની ઉચ્ચ સાંદ્રતા હોવા છતાં, ટર્મિનલ ડોમેન સાથે સંકળાયેલ મોટા પુનરાવર્તિત પ્રદેશનો અર્થ એ છે કે ગ્રંથિમાં NT અને CT ની દેખીતી સાંદ્રતા આ અભ્યાસની સીમા પર, આશરે 10-20 mg/ml ને અનુરૂપ છે.ઇન વિટ્રો અવલોકન કરેલ હાઇડ્રોજેલ રચના માટે જરૂરી.વધુમાં, ક્ષારની સમાન સાંદ્રતા 16 સ્થિર NT, જેમ કે રેશમ ગ્રંથીઓ (ફિગ. 5b).NT રચનાનો અભ્યાસ E. coli cytosol માં કરવામાં આવ્યો છે અને જ્યારે વિટ્રોમાં તપાસ કરવામાં આવે ત્યારે તે વધુ ચુસ્તપણે ફોલ્ડ થયેલ હોવાનું જાણવા મળે છે, જે વધુમાં દર્શાવે છે કે મીઠું અથવા અન્ય પરિબળો તેના વિવોમાં એકત્રીકરણને અટકાવે છે.જો કે, NTs ની β-શીટ ફાઈબ્રિલમાં પરિવર્તિત થવાની ક્ષમતા ફિલામેન્ટની રચના માટે મહત્વપૂર્ણ હોઈ શકે છે અને ભવિષ્યના અભ્યાસોમાં તેની તપાસ થવી જોઈએ.
આ અભ્યાસમાં અવલોકન કરાયેલ NT-amyloid-જેવા ફાઈબ્રિલ અને હાઈડ્રોજેલ રચનાના નવલકથા પાસાઓ ઉપરાંત, અમે એ પણ બતાવીએ છીએ કે આ ઘટનામાં બાયોટેકનોલોજીકલ અને બાયોમેડિકલ એપ્લિકેશન્સ હોઈ શકે છે (ફિગ. 8).ખ્યાલના પુરાવા તરીકે, અમે NT ને GFP અથવા PNP સાથે જોડી દીધું અને દર્શાવ્યું કે ફ્યુઝન પ્રોટીન જ્યારે 37 °C પર ઉકાળવામાં આવે ત્યારે હાઇડ્રોજેલ્સ પણ બનાવે છે અને GFP અને PNP અપૂર્ણાંક મોટાભાગે જલીકરણ પછી તેમની પ્રવૃત્તિ જાળવી રાખે છે (આકૃતિ 6).ન્યુક્લિયોસાઇડ ફોસ્ફોરીલેસિસ એ ન્યુક્લિયોસાઇડ એનાલોગ 75 ના મહત્વપૂર્ણ ઉત્પ્રેરક સંશ્લેષણ છે, જે અમારી શોધને બાયોફાર્માસ્યુટિકલ ઉદ્યોગ માટે સુસંગત બનાવે છે.ફ્યુઝન પ્રોટીનને વ્યક્ત કરવાની વિભાવના જે સાનુકૂળ પરિસ્થિતિઓમાં પારદર્શક હાઇડ્રોજેલ્સ બનાવે છે તે એન્ઝાઇમ સ્થાવરીકરણ, નિયંત્રિત ડ્રગ રીલીઝ અને ટીશ્યુ એન્જિનિયરિંગ જેવી વિશાળ શ્રેણી માટે અનુકૂળ ગુણધર્મો સાથે કાર્યાત્મક હાઇડ્રોજેલ્સ બનાવવાની મંજૂરી આપે છે.વધુમાં, NT અને NT* એ કાર્યક્ષમ અભિવ્યક્તિ માર્કર્સ છે30, જેનો અર્થ છે કે NT અને તેના વેરિઅન્ટ્સનો ઉપયોગ દ્રાવ્ય ફ્યુઝન પ્રોટીનના ઉચ્ચ-થ્રુપુટ ઉત્પાદન અને 3D હાઈડ્રોજેલ્સમાં સ્થિર લક્ષ્ય પ્રોટીનના અનુગામી સર્જન માટે થઈ શકે છે.
NT દ્રાવ્ય, α-હેલિકલ અને ઓછી સાંદ્રતા (µM) અને 37°C પર સ્થિર છે.સમાન તાપમાને, પરંતુ વધતી સાંદ્રતા પર (>10 mg/ml), NT જેલ બનાવે છે જેમાં એમીલોઈડ જેવા ફાઈબ્રિલ્સનો સમાવેશ થાય છે.એનટી ફ્યુઝન પ્રોટીન પણ સંપૂર્ણ કાર્યાત્મક ફ્યુઝન ટુકડાઓ સાથે ફાઇબરિલર જેલ્સ બનાવે છે, જે એનટીનો ઉપયોગ કરીને વિવિધ પ્રોટીનને 3D હાઇડ્રોજેલ્સમાં સ્થિર થવા દે છે.તળિયે: NT (PDB: 4FBS) અને ફાઇબર નેટવર્ક્સ અને સંકળાયેલ પ્રોટીન સ્ટ્રક્ચર્સના ચિત્રો (ધારેલા અને સ્કેલ પર દોરેલા નથી, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.22210/pdbRdJ).
રચનાઓ (એમિનો એસિડ સિક્વન્સ સહિતની સંપૂર્ણ સૂચિ માટે પૂરક કોષ્ટક 4 જુઓ) પ્લાઝમિડ pT7 માં ક્લોન કરવામાં આવ્યા હતા અને E. coli BL21 (DE3) માં પરિવર્તિત થયા હતા.ઇ. કોલી જેમાં એન્જિનિયર્ડ પ્લાઝમિડ્સ હોય છે તેને કેનામિસિન (70 mg/l) સાથે પૂરક લુરિયા બ્રોથમાં ઇનોક્યુલેટ કરવામાં આવ્યું હતું અને 30°C અને 250 rpm પર રાતોરાત ઉગાડવામાં આવ્યું હતું.ત્યારબાદ કલ્ચરને કેનામાસીન ધરાવતા LB માધ્યમમાં 1/100 ઇનોક્યુલેટ કરવામાં આવ્યું હતું અને OD600 0.8 સુધી પહોંચે ત્યાં સુધી 30°C અને 110 rpm પર કલ્ચર કરવામાં આવ્યું હતું.NMR અભ્યાસો માટે, બેક્ટેરિયાને M9 ન્યૂનતમ માધ્યમમાં ઉગાડવામાં આવ્યા હતા જેમાં 2 ગ્રામ D-ગ્લુકોઝ 13C (એલ્ડ્રિચ) અને 1 ગ્રામ એમોનિયમ ક્લોરાઇડ 15N (કેમ્બ્રિજ આઇસોટોપ લેબોરેટરીઝ, ઇન્ક.) આઇસોટોપ સાથે પ્રોટીન લેબલિંગ માટે છે.તાપમાનને 20 ડિગ્રી સેલ્સિયસ સુધી ઓછું કરો અને 0.15 એમએમ આઇસોપ્રોપીલથિઓગલાક્ટોપાયરાનોસાઇડ (અંતિમ સાંદ્રતા) સાથે પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ પ્રેરિત કરો.રાતોરાત પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ પછી, 20 મિનિટ માટે 7278×g, 4°C પર કોષોની લણણી કરવામાં આવી હતી.સેલ પેલેટ્સને 20 એમએમ ટ્રિસ-એચસીએલ, પીએચ 8 માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા હતા અને આગળના ઉપયોગ સુધી સ્થિર કરવામાં આવ્યા હતા.ઓગળેલા કોષોને 30 kPa પર સેલ ડિસપ્ટર (TS સિરીઝ મશીનો, કોન્સ્ટન્ટ સિસ્ટમ્સ લિમિટેડ, ઈંગ્લેન્ડ) નો ઉપયોગ કરીને લિઝ કરવામાં આવ્યા હતા.પછી લિસેટ્સને 4°C પર 30 મિનિટ માટે 25,000 ગ્રામ પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યા હતા.NTMiSp માટે, પેલેટને 2 M યુરિયા, 20 mM Tris-HCl, pH 8 માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવી હતી અને 2 મિનિટ (2 s ચાલુ/બંધ, 65%) માટે સોનિકેટ કરવામાં આવી હતી, પછી ફરીથી 25,000 xg, 4° C. અંદર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવી હતી. 30 મિનિટસુપરનેટન્ટને ની-એનટીએ કૉલમ પર લોડ કરવામાં આવ્યું હતું, તેને 20 એમએમ ટ્રિસ-એચસીએલ, 2 એમએમ ઇમિડાઝોલ, પીએચ 8 વડે ધોવામાં આવ્યું હતું અને અંતે પ્રોટીનને 20 એમએમ ટ્રિસ-એચસીએલ, 200 એમએમ ઇમિડાઝોલ, પીએચ 8 સાથે ધોવામાં આવ્યું હતું. NT2RepCT અને જનરેટ કરવા માટે એનટીસીટી, થ્રોમ્બિન પાચન હિસ અને એનટી વચ્ચેની સાઇટ (થ્રક્લીવ) નો પરિચય કરાવે છે.થ્રોમ્બિન ક્લીવેજ સાઇટ્સ His-NT-ThrCleav-2Rep (2Rep ઉત્પન્ન કરે છે), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (NT ઉત્પન્ન કરે છે), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (CT ઉત્પન્ન કરે છે), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT માં પણ હાજર છે. .* (NT* ઉત્પન્ન કરે છે), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R ઉત્પન્ન કરે છે), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp ઉત્પન્ન કરે છે), અને હિઝ-સલ્ફર રેડોક્સિન-ThrCleav-NTMiSp (એનટીએમઆઈએસપી ઉત્પન્ન કરે છે).6-8 kDa ના મોલેક્યુલર વેઇટ થ્રેશોલ્ડ સાથે સ્પેક્ટ્રા/પોર ડાયાલિસિસ મેમ્બ્રેનનો ઉપયોગ કરીને 20 એમએમ ટ્રિસ-એચસીએલ, પીએચ 8 સાથે, થ્રોમ્બિન (1:1000) વડે રચનાઓનું પાચન કરવામાં આવ્યું હતું અને 4° સે. પર રાતોરાત ડાયલાઇઝ કરવામાં આવ્યું હતું.ડાયાલિસિસ પછી, દ્રાવણને Ni-NTA કૉલમ પર લોડ કરવામાં આવે છે અને રસનું પ્રોટીન ધરાવતું પ્રવાહી એકત્ર કરવામાં આવે છે.પ્રોટીનની સાંદ્રતા દરેક પ્રોટીનના લુપ્તતા ગુણાંકનો ઉપયોગ કરીને 280 nm પર યુવી શોષકતાને માપીને નક્કી કરવામાં આવી હતી, સિવાય કે NTF1Sp, જે ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલ અનુસાર બ્રેડફોર્ડ એસેનો ઉપયોગ કરે છે.શુદ્ધતા SDS પોલિએક્રીલામાઇડ (4–20%) જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ અને Coomassie બ્રિલિયન્ટ બ્લુ સ્ટેનિંગ દ્વારા નક્કી કરવામાં આવી હતી.20 મિનિટના ચક્રમાં 10 kDa મોલેક્યુલર વેઇટ કટઓફ સાથે 4000 xg પર સેન્ટ્રીફ્યુજ ફિલ્ટર્સ (VivaSpin 20, GE Healthcare) નો ઉપયોગ કરીને પ્રોટીનને કેન્દ્રિત કરવામાં આવ્યું હતું.
પ્રોટીન સોલ્યુશનને પીગળીને 150 μl ને 1 મિલી ક્લીયર સેપ્ટમ શીશી (8 x 40 mm થર્મો સાયન્ટિફિક) માં કાળજીપૂર્વક પાઈપેટ કરો.બાષ્પીભવન અટકાવવા માટે નળીઓને પેરાફિલ્મથી બંધ કરીને સીલ કરવામાં આવી હતી.નમૂનાઓ (n = 3) 37°C અથવા 60°C પર ઉકાળવામાં આવ્યા હતા અને સમયાંતરે જીલેશન અવલોકન કરવા માટે ઊંધી કરવામાં આવ્યા હતા.જેલ ન હોય તેવા નમૂનાઓ ઓછામાં ઓછા એક અઠવાડિયા માટે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા.10 µM પ્રોટીન દીઠ 10 mM DTT સાથે NTMiSp ડાઈસલ્ફાઈડ બોન્ડમાં ઘટાડો.કુદરતી કરોળિયાના રેશમના થરનું વિશ્લેષણ કરવા માટે, સ્વીડિશ બ્રિજ સ્પાઈડરને કાપવામાં આવ્યો હતો, બે મુખ્ય એમ્પ્યુલેટેડ ગ્રંથીઓને 20 mM Tris-HCl બફર pH 8 ના 200 μl માં મૂકવામાં આવી હતી અને કોટિંગને ગ્રંથીઓથી અલગ થવા દેવા માટે કાપવામાં આવી હતી..ગ્રંથીઓની સામગ્રી બફરમાં ઓગળવામાં આવે છે, શુષ્ક વજનના નિર્ધારણ માટે 50 µl (60 °C પર સતત વજનમાં ખુલ્લી શીશીઓના સેવન દ્વારા) અને 37 °C પર જીલેશન માટે 150 µl.
માપન ભૂમિતિ/ટૂલ 20 મીમીના ટોચના વ્યાસ અને 0.5 મીમીના અંતર સાથે સમાંતર પ્લેટનો ઉપયોગ કરીને સ્ટેનલેસ સ્ટીલથી બનેલું છે.સ્ટેનલેસ સ્ટીલ બોટમ પેલ્ટિયર પ્લેટનો ઉપયોગ કરીને નમૂનાને 25 °C થી 45 °C અને 1 °C પ્રતિ મિનિટના દરે 25 °C પર પાછા ગરમ કરો.100 mg/mL અને 300–500 mg/mL ના નમૂનાઓ માટે અનુક્રમે 0.1 Hz ની આવર્તન પર અને સામગ્રીના રેખીય વિસ્કોએલાસ્ટિક પ્રદેશમાં 5% અને 0.5% ની તાણ પર કંપન માપન હાથ ધરવામાં આવ્યું હતું.બાષ્પીભવન અટકાવવા કસ્ટમ ભેજ ચેમ્બરનો ઉપયોગ કરો.પ્રિઝમ 9 નો ઉપયોગ કરીને ડેટાનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
ઇન્ફ્રારેડ (IR) સ્પેક્ટ્રાને ઓરડાના તાપમાને 800 થી 3900 cm–1 એકત્ર કરવા માટે.એટીઆર ઉપકરણ, તેમજ સ્પેક્ટ્રોમીટર દ્વારા પ્રકાશ પાથ, પ્રયોગ પહેલાં અને તે દરમિયાન શુષ્ક ફિલ્ટર કરેલ હવાથી શુદ્ધ કરવામાં આવે છે.સોલ્યુશન્સ (સ્પેક્ટ્રામાં પાણીના શોષણના શિખરોને ઘટાડવા માટે 500 mg/mL) સ્ફટિકો પર પાઈપેટ કરવામાં આવ્યા હતા, અને જેલ્સ (500 mg/mL) માપવા પહેલા બનાવવામાં આવ્યા હતા અને પછી સ્ફટિકોમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવ્યા હતા (n = 3).1000 સ્કેન 2 સેમી-1ના રિઝોલ્યુશન સાથે અને 2ના શૂન્ય ડ્યુટી સાયકલ સાથે રેકોર્ડ કરવામાં આવ્યા હતા. બીજા ડેરિવેટિવની ગણતરી OPUS (બ્રુકર) નો ઉપયોગ કરીને નવ પોઈન્ટની સ્મૂથિંગ રેન્જનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી.F. Menges “Spectragryph – Optical Spectroscopy Software” નો ઉપયોગ કરીને 1720 અને 1580 cm-1 ની વચ્ચે સમાન એકીકરણ પ્રદેશમાં સ્પેક્ટ્રાને સામાન્ય બનાવવામાં આવ્યા હતા.ATR-IR સ્પેક્ટ્રોસ્કોપીમાં, નમૂનામાં ઇન્ફ્રારેડ બીમની ઘૂંસપેંઠ ઊંડાઈ તરંગ સંખ્યા આધારિત હોય છે, જેના પરિણામે ઉચ્ચ વેવનમ્બર કરતાં નીચા તરંગસંખ્યા પર વધુ મજબૂત શોષણ થાય છે.ફિગમાં બતાવેલ સ્પેક્ટ્રા માટે આ અસરો સુધારાઈ નથી.3 કારણ કે તેઓ ખૂબ નાના છે (પૂરક ફિગ. 4).આ આંકડા માટે યોગ્ય સ્પેક્ટ્રાની ગણતરી Bruker OPUS સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી.
સૈદ્ધાંતિક રીતે, એમાઈડ I ટોચની અંદરના ઘટકોના વિશ્વસનીય ડીકોનવોલ્યુશન પછી પ્રોટીન કન્ફોર્મેશનનું વ્યાપક પ્રમાણીકરણ શક્ય છે.જો કે, વ્યવહારમાં કેટલાક અવરોધો ઉભા થાય છે.ડીકોનવોલ્યુશન દરમિયાન સ્પેક્ટ્રમમાં અવાજ (ખોટા) શિખરો તરીકે દેખાઈ શકે છે.વધુમાં, પાણીના વળાંકને કારણે શિખર એમાઈડ I શિખરની સ્થિતિ સાથે એકરુપ છે અને મોટા પ્રમાણમાં પાણી ધરાવતા નમૂનાઓ માટે સમાન તીવ્રતા હોઈ શકે છે, જેમ કે અહીં અભ્યાસ કરાયેલ જલીય જેલ.તેથી, અમે એમાઈડ I પીકને સંપૂર્ણપણે વિઘટિત કરવાનો પ્રયાસ કર્યો ન હતો, અને અમારા અવલોકનો માત્ર NMR સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી જેવી અન્ય પદ્ધતિઓના સમર્થનમાં ધ્યાનમાં લેવા જોઈએ.
50 mg/ml NT અને His-NT2RepCT ના સોલ્યુશન્સ 37 ° સે પર રાતોરાત જેલ કરવામાં આવ્યા હતા.પછી હાઇડ્રોજેલને 20 એમએમ ટ્રિસ-એચસીએલ (પીએચ 8) સાથે 12.5 એમજી/એમએલની સાંદ્રતામાં પાતળું કરવામાં આવ્યું, સારી રીતે હલાવવામાં આવ્યું અને જેલને તોડવા માટે પાઇપેટ કરવામાં આવ્યું.આગળ, હાઇડ્રોજેલને 20 એમએમ ટ્રિસ-એચસીએલ (પીએચ 8) સાથે 10 વખત પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું, નમૂનાનો 5 μl ફોર્મવર સાથે કોટેડ કોપર ગ્રીડ પર લાગુ કરવામાં આવ્યો હતો, અને વધારાના નમૂનાને બ્લોટિંગ પેપરથી દૂર કરવામાં આવ્યો હતો.નમૂનાઓને 5 µl MilliQ પાણીથી બે વાર ધોવામાં આવ્યા હતા અને 5 મિનિટ માટે 1% યુરેનાઇલ ફોર્મેટથી ડાઘ કરવામાં આવ્યા હતા.શોષક કાગળ વડે વધારાના ડાઘ દૂર કરો, પછી જાળીને હવામાં સૂકવી દો.100 kV પર કાર્યરત FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN નો ઉપયોગ કરીને આ ગ્રીડ પર ઇમેજિંગ કરવામાં આવ્યું હતું.વેલેટા 2k × 2k CCD કેમેરા (ઓલિમ્પસ સોફ્ટ ઇમેજિંગ સોલ્યુશન્સ, GmbH, મ્યુન્સ્ટર, જર્મની) નો ઉપયોગ કરીને x 26,500 અને x 43,000 મેગ્નિફિકેશન પર છબીઓ રેકોર્ડ કરવામાં આવી હતી.દરેક નમૂના માટે (n = 1), 10-15 છબીઓ રેકોર્ડ કરવામાં આવી હતી.ઇમેજજે (https://imagej.nih.gov/) નો ઉપયોગ ફાઇબર વ્યાસ (n = 100, વિવિધ ફાઇબર) ની છબી વિશ્લેષણ અને માપન માટે કરવામાં આવ્યો હતો.પ્રિઝમ 9 નો ઉપયોગ અનપેયર્ડ ટી-ટેસ્ટ્સ (બે પૂંછડીવાળા) કરવા માટે થતો હતો.સરેરાશ His-NT2RepCT અને NT ફાઈબ્રિલ્સ અનુક્રમે 11.43 (SD 2.035) અને 7.67 (SD 1.389) nm હતા.આત્મવિશ્વાસ અંતરાલ (95%) -4.246 થી -3.275 છે.સ્વતંત્રતાની ડિગ્રી = 198, p < 0.0001.
કોર્નિંગ 96-વેલ બ્લેક બોટમ ક્લિયર બોટમ પ્લેટ્સ (કોર્નિંગ ગ્લાસ 3881, યુએસએ) નો ઉપયોગ કરીને સ્થિર સ્થિતિમાં 10 µM થીઓફ્લેવિન T (ThT) ધરાવતા 80 µl પ્રવાહી નમૂનાઓ ટ્રિપ્લિકેટ (n = 3) માં માપવામાં આવ્યા હતા.440 nm ઉત્તેજના ફિલ્ટર અને 480 nm ઉત્સર્જન ફિલ્ટર (BMG Labtech, Offenburg, Germany માંથી FLUOStar Galaxy) નો ઉપયોગ કરીને ફ્લોરોસેન્સ તફાવતો રેકોર્ડ કરવામાં આવ્યા હતા.ThT સિગ્નલ ન તો સંતૃપ્ત થયું હતું કે ન તો શમ્યું હતું, કારણ કે સિગ્નલની તીવ્રતા બદલ્યા વિના ThTની વિવિધ સાંદ્રતા સાથે પ્રયોગો કરવામાં આવ્યા હતા.ધુમ્મસ માપન માટે 360 nm પર રેકોર્ડ શોષકતા.બિયારણના પ્રયોગો માટે, 100 mg/mL જેલ 37 ° સે. પર બનાવવામાં આવ્યા હતા, ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા હતા અને 5%, 10% અને 20% ના દાઢ ગુણોત્તર પર બીજ વાવવા માટે ઉપયોગમાં લેવાય છે.પ્રિઝમ 9 નો ઉપયોગ કરીને ડેટાનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
હિઝ-NT2RepCT અને NT>100 mg/mL ના સ્ટોકને બરફ પર પીગળીને 0.22 µm ફિલ્ટર દ્વારા ફિલ્ટર કરો.Nanodrop નો ઉપયોગ કરીને 280 nm પર શોષકતા માપીને સાંદ્રતાની ગણતરી કરવામાં આવી હતી.96-વેલ બ્લેક નોન-બાઈન્ડિંગ પ્લેટ (કોર્નિંગ) ના કુવાઓમાં સ્પષ્ટ તળિયે, નમૂનાઓને 20 mM Tris-HCl pH 8 માં 20 mg/ml માં ભેળવવામાં આવ્યા હતા અને 5 μM ThT (અંતિમ સાંદ્રતા), કુલ નમૂના સાંદ્રતા સાથે મિશ્રિત કરવામાં આવ્યા હતા. 50 μl વોલ્યુમ.સેલઓબ્ઝર્વર (ઝીસ) માઇક્રોસ્કોપ પર ટ્રાન્સમિટેડ લાઇટ ચેનલ અને FITC ઉત્તેજના અને ThT ઇમેજિંગ માટે ઉત્સર્જન ફિલ્ટર સેટ સાથે દર 10 મિનિટે 37 °C પર નમૂનાઓની છબી લેવામાં આવી હતી.ઇમેજિંગ માટે 20x/0.4 લેન્સનો ઉપયોગ થાય છે.ઝેન બ્લુ (ઝીસ) અને ઈમેજજે (https://imagej.nih.gov/) નો ઉપયોગ ઈમેજ વિશ્લેષણ માટે કરવામાં આવ્યો હતો.જેલ્સ પણ NT અને His-NT2RepCT સોલ્યુશન્સમાંથી 50 mg/mL ની સાંદ્રતામાં તૈયાર કરવામાં આવ્યા હતા જેમાં 20 mM Tris pH 8 અને 5 µM ThT હોય છે અને 90 મિનિટ માટે 37°C પર ઉકાળવામાં આવે છે.જેલના ટુકડાઓ 20 mM Tris, pH 8, અને 5 μM ThT ધરાવતાં નવા કૂવામાં તબદીલ કરવામાં આવ્યા હતા જેમાં બિન-બંધનકર્તા કાળી 96 સારી રીતે સ્પષ્ટ તળિયાની પ્લેટ હતી.20x/0.4 મેગ્નિફિકેશન પર ગ્રીન ફ્લોરોસેન્સ અને તેજસ્વી ક્ષેત્રની છબીઓ મેળવો.ઈમેજજેનો ઉપયોગ ઈમેજ વિશ્લેષણ માટે કરવામાં આવ્યો હતો.
સોલ્યુશન NMR સ્પેક્ટ્રા 310 K પર 600 MHz Bruker Avance Neo સ્પેક્ટ્રોમીટર પર QCI ક્વાડ્રુપોલ રેઝોનન્સ પલ્સ્ડ ગ્રેડિયન્ટ ફીલ્ડ ક્રાયોપ્રોબ (HFCN)થી સજ્જ કરવામાં આવ્યું હતું.13C, 15N સાથે લેબલવાળા 10 mg/mL સજાતીય પ્રોટીન ધરાવતા NMR નમૂનાઓ, 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) માં ઓગળેલા .15N-HSQC ના 2D સ્પેક્ટ્રમમાં પીક 23 સોંપવા માટે pH 6.7 પર NT2RepCT ના રાસાયણિક પાળીનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.
3.2 mm 13C/15N{1H} ઇલેક્ટ્રોનલેસ પ્રોબથી સજ્જ 800 MHz પર Bruker Avance III HD સ્પેક્ટ્રોમીટર પર 13C, 15N-લેબલવાળા હાઇડ્રોજેલ્સનો મેજિક એંગલ સ્પિનિંગ સોલિડ NMR (MAS) સ્પેક્ટ્રા રેકોર્ડ કરવામાં આવ્યો હતો.નમૂનાનું તાપમાન 277 K પર વેરિયેબલ તાપમાન ગેસ સ્ટ્રીમનો ઉપયોગ કરીને નિયંત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું. દ્વિ-પરિમાણીય દ્વિધ્રુવીય રોટેશનલ રેઝોનન્સ (DARR)76 અને રેડિયો ફ્રીક્વન્સી રિકનેક્શન (RFDR)77 સ્પેક્ટ્રા અનુક્રમે 12.5 kHz અને 20 kHz ની MAS ફ્રીક્વન્સીઝ પર હસ્તગત કરવામાં આવ્યા હતા.1H થી 13C સુધી ક્રોસ પોલરાઇઝેશન (CP) 1H પર 60.0 થી 48.0 kHz, 13C પર 61.3/71.6 kHz (12.5/20 kHz MAS પર) અને સંપર્ક સમય 0.5–1 ms પર રેખીય રેમ્પનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું.ડેટા સંગ્રહ દરમિયાન 73.5 kHz પર સ્પાઇનલ 6478 ડીકોપ્લિંગનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.સંપાદનનો સમય 10 મિલીસેકન્ડનો હતો અને ચક્રમાં વિલંબ 2.5 સેકન્ડ હતો.RFDR સ્પેક્ટ્રામાં જોવામાં આવેલ સિંગલ-લિંક્ડ Cα/Cβ સહસંબંધો લાક્ષણિક અવશેષ-પ્રકારની રાસાયણિક પાળી અને DARR સ્પેક્ટ્રામાં ગુણાકાર-લિંક્ડ સહસંબંધોના આધારે સોંપવામાં આવ્યા હતા.
Zipper79 ડેટાબેઝ (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) નો ઉપયોગ NT, NTFlSp અને NTMiSp માટે ફ્લટર વલણ અને રોસેટા ઊર્જાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.ઝિપર ડેટાબેઝ રોસેટા એનર્જી 80 ની ગણતરી કરે છે, જે પ્રોટીન સ્ટ્રક્ચરનું મોડેલ અને વિશ્લેષણ કરવા માટે ઘણા મુક્ત ઊર્જા કાર્યોને જોડે છે.-23 kcal/mol અથવા નીચું ઉર્જા સ્તર ફાઈબ્રિલેટની ઊંચી વૃત્તિ દર્શાવે છે.નીચી ઉર્જાનો અર્થ છે ઝિપર કન્ફોર્મેશનમાં બે β-સ્ટ્રેન્ડની વધુ સ્થિરતા.વધુમાં, વોલ્ટ્ઝ અલ્ગોરિધમનો ઉપયોગ NT, NTFlSp અને NTMiSp રેફમાં એમાયલોઇડોજેનિક પ્રદેશોની આગાહી કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT પ્રોટીન સોલ્યુશનને pH 5.5 અને 6.0 પર 2-(N-morpholino) ઇથેનેસલ્ફોનિક એસિડ (MES) બફર સાથે ભેળવવામાં આવ્યું હતું જેથી pH ને અનુક્રમે pH 6 અને 7 કરવામાં આવે.અંતિમ પ્રોટીન સાંદ્રતા 100 મિલિગ્રામ/એમએલ હતી.
J-1500 CD સ્પેક્ટ્રોમીટર (JASCO, USA) પર 0.1 સે.મી.ના ઓપ્ટિકલ પાથ સાથે 300 μL ક્યુવેટનો ઉપયોગ કરીને માપન કરવામાં આવ્યું હતું.20 એમએમ ફોસ્ફેટ બફર (pH 8) માં પ્રોટીનને 10 μM (n = 1) સુધી પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું.મીઠાની હાજરીમાં પ્રોટીનની સ્થિરતાનું વિશ્લેષણ કરવા માટે, અનુક્રમે 154 mM NaF અથવા NaCl ધરાવતા 20 mM ફોસ્ફેટ બફર (pH 8) માં સમાન સાંદ્રતા (n = 1) પર પ્રોટીનનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.તાપમાન સ્કેન 25°C થી 95°C સુધી 1°C/min ના હીટિંગ રેટ સાથે 222 nm પર રેકોર્ડ કરવામાં આવ્યું હતું.મૂળ રીતે ફોલ્ડ કરેલ પ્રોટીનનું પ્રમાણ સૂત્ર (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal) નો ઉપયોગ કરીને ગણવામાં આવ્યું હતું.વધુમાં, દરેક નમૂના માટે 260 nm થી 190 nm સુધી 25 ° સે અને 95 ° સે સુધી ગરમ કર્યા પછી પાંચ સ્પેક્ટ્રા રેકોર્ડ કરવામાં આવ્યા હતા.પાંચ સ્પેક્ટ્રા સરેરાશ, સરળ અને દાઢ લંબગોળતામાં રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યા હતા.પ્રિઝમ 9 નો ઉપયોગ કરીને ડેટાનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
હિસ-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) ની ફ્લોરોસેન્સ તીવ્રતા સ્થિર સ્થિતિમાં કાળા પારદર્શક તળિયા (કોર્નિંગ ગ્લાસ 3881, યુએસએ) સાથે 96-વેલ કોર્નિંગ પ્લેટોમાં ત્રિપુટી (n = 3) માં માપવામાં આવી હતી.395 nm ની ઉત્તેજના તરંગલંબાઇ સાથે ફ્લોરોસેન્સ-આધારિત પ્લેટ રીડર વડે નમૂનાઓને માપો અને ઉત્સર્જનને 509 nm પર જિલેશન પહેલાં અને 2 કલાક પછી 37°C પર રેકોર્ડ કરો.પ્રિઝમ 9 સાથે ડેટાનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર પ્યુરિન ન્યુક્લિયોસાઇડ ફોસ્ફોરીલેઝ એક્ટિવિટી એસે કીટ (ફ્લોરોમેટ્રિક પદ્ધતિ, સિગ્મા એલ્ડ્રીચ) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.હિસ-NT-PNP ધરાવતા જેલ અને સોલ્યુશનમાં પ્રવૃત્તિને માપવા માટે, His-NT-PNP ના 10 ng ને 100 mg/mL NT સાથે 2 µL ના કુલ વોલ્યુમમાં મિક્સ કરો કારણ કે જેલ સેટના ડિટેક્શન અંતરાલની ઉપર સંકેત આપે છે.હિઝ-એનટી-પીએનપી વગરના જેલ અને સોલ્યુશન્સ માટેના નિયંત્રણોનો સમાવેશ કરવામાં આવ્યો હતો.માપન બે વખત હાથ ધરવામાં આવ્યું હતું (n = 2).પ્રવૃત્તિ માપવામાં આવ્યા પછી, પ્રતિક્રિયા મિશ્રણ દૂર કરવામાં આવ્યું હતું અને માપન દરમિયાન જેલ અકબંધ રહે તેની ખાતરી કરવા માટે જેલ ફોટોગ્રાફ કરવામાં આવી હતી.પ્રિઝમ 9 નો ઉપયોગ કરીને ડેટાનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
અભ્યાસ ડિઝાઇન પર વધુ માહિતી માટે, આ લેખ સાથે લિંક કરેલ પ્રકૃતિ અભ્યાસ અમૂર્ત જુઓ.
આંકડા 1 અને 2 પ્રારંભિક ડેટા રજૂ કરે છે.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, અને 6, પૂરક ફિગ.3, પૂરક અંજીર.5a, d, પૂરક ફિગ.6 અને પૂરક અંજીર.8. આ અભ્યાસમાંથી ડેટા ડેટા ઝેનોડો ડેટાબેઝ https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653 માં હોસ્ટ કરવામાં આવ્યો છે.આ અભ્યાસમાં મેળવેલ NMR ડેટા એન્ટ્રી ID bmrbig36 હેઠળ BMRBig રિપોઝીટરીમાં પોસ્ટ કરવામાં આવ્યો હતો.GFP અને PNP ની રચના PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2) માંથી લેવામાં આવી હતી.
રાઇઝિંગ, એ. અને જોહાન્સન, જે. કૃત્રિમ સ્પાઈડર સિલ્ક સ્પિનિંગ.નેશનલ કેમિકલ.બાયોલોજી.11, 309–315 (2015).
બબ્બ, પીએલ એટ અલ.નેફિલા ક્લેવિપ્સ જીનોમ સ્પાઈડર સિલ્ક જનીનોની વિવિધતા અને તેમની જટિલ અભિવ્યક્તિને પ્રકાશિત કરે છે.નેશનલ જેનેટ.49, 895–903 (2017).