ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 રાસાયણિક ઉદ્યોગના રાસાયણિક ઘટક માટે ડુપ્લેક્સ વેલ્ડેડ ટ્યુબ , SPECC1L ની ઉણપ સ્પ્લિસ્ડ સાંધાઓની સ્થિરતા અને ક્રેનિયલ ન્યુરલ ક્રેસ્ટ કોશિકાઓના ઘટાડાની સ્થિરતા તરફ દોરી જાય છે.

Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર.તમે મર્યાદિત CSS સપોર્ટ સાથે બ્રાઉઝર સંસ્કરણનો ઉપયોગ કરી રહ્યાં છો.શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે અપડેટ કરેલ બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરો (અથવા Internet Explorer માં સુસંગતતા મોડને અક્ષમ કરો).વધુમાં, ચાલુ સમર્થનની ખાતરી કરવા માટે, અમે શૈલીઓ અને JavaScript વિના સાઇટ બતાવીએ છીએ.

રાસાયણિક ઉદ્યોગ માટે ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 ડુપ્લેક્સ વેલ્ડેડ ટ્યુબ

લિયાઓચેંગ સિહે એસએસ મટિરિયલ કો., લિ.એક અગ્રણી ઉત્પાદક છે જે સ્ટેનલેસ સ્ટીલ સીમલેસ પાઈપો, બ્રાઈટ એનિલેડ ટ્યુબ, સીમલેસ કોઈલેડ ટ્યુબિંગ વગેરેમાં વિશેષતા ધરાવે છે.ગ્રાહકોને સુવિધા આપવા માટે, અમારી પાસે વેલ્ડેડ પાઈપો અને ટ્યુબ પણ છે.લિયાઓચેંગ સિહે એસએસ મટિરિયલ કો., લિ.સૌથી અદ્યતન ઉત્પાદન અને પરીક્ષણ સાધનો ધરાવે છે.અમે તમારી જરૂરિયાતને સંપૂર્ણપણે સંતોષી શકીએ છીએ.ખૂબ જ કડક ધોરણો અનુસાર, અમારા દ્વારા ઉત્પાદિત ટ્યુબમાં હંમેશા યોગ્ય OD અને WT સહિષ્ણુતા હોય છે.સહનશીલતા નિયંત્રણ સખત રીતે ઉત્પાદન ધોરણો અનુસાર છે.અમારા ઉત્પાદનો હંમેશા ગ્રાહકો સાથે સંતુષ્ટ છે.ગ્રાહકોએ અમારા ઉત્પાદનો ખરીદ્યા અને વધુ નફો કર્યો.
a) OD (બાહ્ય વ્યાસ): 3.18mm થી 101.6mm
b) WT (દિવાલની જાડાઈ): 0.5mm થી 20mm
c) લંબાઈ: ગ્રાહકની જરૂરિયાત મુજબ
ડી) ધોરણો : ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 વગેરે
e) પ્રક્રિયા પદ્ધતિ : ERW, EFW વગેરે

સ્લાઇડર્સ સ્લાઇડ દીઠ ત્રણ લેખો દર્શાવે છે.સ્લાઇડ્સમાંથી આગળ વધવા માટે પાછળના અને આગળના બટનોનો ઉપયોગ કરો અથવા દરેક સ્લાઇડમાંથી આગળ વધવા માટે અંતે સ્લાઇડ કંટ્રોલર બટનોનો ઉપયોગ કરો.
ક્રેનિયલ ન્યુરલ ક્રેસ્ટ કોશિકાઓ (CNCC) એમ્બ્રોનિક ન્યુરલ ફોલ્ડ્સને બંધ કરી દે છે અને ફેરીન્જિયલ કમાનો તરફ સ્થળાંતર કરે છે, જે મોટાભાગની મિડફેસ સ્ટ્રક્ચર્સ બનાવે છે.CNCC ડિસફંક્શન ઓરોફેસિયલ ક્લેફ્ટના ઈટીઓલોજીમાં મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવે છે, જે એક સામાન્ય જન્મજાત ખોડખાંપણ છે.એટીપિકલ અને સિન્ડ્રોમિક ક્લેફ્ટ્સ ધરાવતા દર્દીઓમાં હેટરોઝાયગસ SPECC1L પરિવર્તન જોવા મળ્યું છે.અહીં, અમે સંસ્કારી SPECC1L નોકડાઉન કોષોમાં કેનોનિકલ એડહેસિવ જંકશન (AJ) ઘટકો, β-કેટેનિન અને E-cadherin ના ઉન્નત સ્ટેનિંગની જાણ કરીએ છીએ, અને ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોગ્રાફ્સ AJ ના એપિકલ-બેઝલ પ્રસરણ દર્શાવે છે.ક્રેનિયોફેસિયલ મોર્ફોજેનેસિસમાં SPECC1L ની ભૂમિકાને સમજવા માટે, અમે Specc1l ની ખામીયુક્ત માઉસ મોડેલ બનાવ્યું છે.હોમોઝાયગસ મ્યુટન્ટ્સ એમ્બ્રોનિક ઘાતક છે અને ક્ષતિગ્રસ્ત ન્યુરલ ટ્યુબ બંધ અને CNCC લેમિનેશન દર્શાવે છે.મ્યુટન્ટ ન્યુરલ ફોલ્ડ્સમાં AJ પ્રોટીન સ્ટેનિંગ વધે છે.આ AJ ખામી CNCC ડિલેમિનેશનમાં ખામી સાથે સુસંગત છે, જેને AJ વિસર્જનની જરૂર છે.વધુમાં, Specc11 મ્યુટન્ટ્સે PI3K-AKT સિગ્નલિંગમાં ઘટાડો કર્યો છે અને એપોપ્ટોસિસમાં વધારો કર્યો છે.વિટ્રોમાં, જંગલી પ્રકારના કોષોમાં PI3K-AKT સિગ્નલિંગનો હળવો અવરોધ AJ ફેરફારોને પ્રેરિત કરવા માટે પૂરતો હતો.અગત્યની રીતે, SPECC1L નોકડાઉન દ્વારા પ્રેરિત AJ ફેરફારો PI3K-AKT પાથવેના સક્રિયકરણ દ્વારા ઉલટાવી શકાય છે.એકસાથે લેવામાં આવે તો, આ ડેટા સૂચવે છે કે SPECC1L, PI3K-AKT સિગ્નલિંગ અને AJ બાયોલોજીના નવલકથા નિયમનકાર તરીકે, ન્યુરલ ટ્યુબ ક્લોઝર અને CNCC સ્તરીકરણ માટે જરૂરી છે.
ક્રેનિયલ ન્યુરલ ક્રેસ્ટ કોશિકાઓ (CNCCs) ડોર્સલ ન્યુરોએક્ટોડર્મમાં સ્થાનીકૃત થાય છે અને એપિથેલિયલ-મેસેન્ચાઇમલ ટ્રાન્ઝિશન (EMT) 1,2,3ને સંડોવતા પ્રક્રિયા દ્વારા વિકાસશીલ ન્યુરલ ફોલ્ડ્સના ન્યુરોએપિથેલિયમથી અલગ પડે છે.પ્રિમિગ્રેટીંગ એપિથેલિયલ સીએનસીસી ઇન્ટરસેલ્યુલર જંકશનને વિક્ષેપિત કરે છે અને સ્થાનાંતરિત મેસેનચાઇમલ સીએનસીસી બની જાય છે જે પ્રથમ અને બીજા ફેરીન્જિયલ કમાનો ભરે છે અને મોટાભાગની ક્રેનિયોફેસિયલ કોમલાસ્થિ બનાવે છે.આમ, CNCC કાર્યને નિયંત્રિત કરતા જનીનો ઘણીવાર ક્રેનિયોફેસિયલ જન્મજાત વિસંગતતાઓના ઈટીઓલોજીમાં વિક્ષેપિત થાય છે જેમ કે ઓરોફેસિયલ ક્લેફ્ટ્સ, સૌથી સામાન્ય રીતે એકલા યુએસમાં 1/800 જન્મોને અસર કરે છે.જન્મજાત વિકૃતિઓમાંની એક 8.
CNCC નું ડિલેમિનેશન ઉંદરમાં ગર્ભ વિકાસના 8.5 અને 9.5 દિવસની વચ્ચે અગ્રવર્તી ન્યુરલ ટ્યુબના બંધ થવા સાથે એકરુપ છે.સંખ્યાબંધ માઉસ ઓરોફેસિયલ ક્લેફ્ટ-સંબંધિત જનીનોના મ્યુટન્ટ્સ પણ ન્યુરલ ટ્યુબ ખામીના અમુક સ્વરૂપનું પ્રદર્શન કરે છે, જેમાં Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 અને Pdgfrα12નો સમાવેશ થાય છે.જો કે, ન્યુરલ ટ્યુબ ક્લોઝર અને CNCC સ્તરીકરણની પ્રક્રિયાઓને સ્વતંત્ર ગણી શકાય, કારણ કે Splotch મ્યુટન્ટ માઉસ (Pax3) CNCC સ્તરીકરણ અથવા સ્થળાંતર 13,14 પર કોઈ અસર કર્યા વિના ન્યુરલ ટ્યુબ બંધ થવામાં ખામી દર્શાવે છે.CNCC ડિસેક્શન અને ન્યુરલ ટ્યુબ ક્લોઝરમાં ખામી સાથે વધારાના માઉસ મોડલ્સ આ બે પ્રક્રિયાઓના સામાન્ય પરમાણુ આધારને દર્શાવવામાં મદદ કરશે.
ન્યુરોએપિથેલિયલ કોશિકાઓમાંથી CNCC ને અલગ કરવા માટે એડહેસિવ જંકશન (AJs) ના વિસર્જનની જરૂર છે, જે પ્રોટીન સંકુલથી બનેલું હોય છે, જેમાં અન્યમાં, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin અને α-actinin એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સ 2 સાથે સંકળાયેલ છે. ન્યુરલ ફોલ્ડ્સમાં ઇ-કેડરિનના અતિશય અભિવ્યક્તિ અભ્યાસે CNCC ડિલેમિનેશનમાં ઘટાડો અથવા વિલંબ દર્શાવ્યો છે.તેનાથી વિપરીત, E-cadherin ના દમનથી પ્રારંભિક સ્તરીકરણ 15,16 માં પરિણમે છે.CNCC સ્તરીકરણ દરમિયાન EMT ની મધ્યસ્થી કરનારા ઘણા પરિબળો ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળો (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) અને એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર મેટ્રિક્સ (ECM) રિમોડેલિંગ પ્રોટીન જેમ કે મેટ્રિક્સ મેટાલોપ્રોટીનેસિસ (MMPs) છે, જોકે CNCC એ ડાયરેક્ટ રિમોડેલિંગ પ્રોટીન છે. હજુ સુધી ખબર નથી.PI3K-AKT પાથવે E-cadherin સ્તરનો વિરોધ કરવા માટે જાણીતો છે, મુખ્યત્વે કેન્સર સંશોધન17.તાજેતરના અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે ઉંદરમાં PDGFα-આધારિત PI3K-AKT સિગ્નલિંગની ખોટ ક્રેનિયોફેસિયલ અસાધારણતા તરફ દોરી જાય છે, જેમાં ક્લેફ્ટ પેલેટ અને ન્યુરલ ટ્યુબ ખામીઓ 12નો સમાવેશ થાય છે.જો કે, CNCC સ્તરીકરણ પર PI3K-AKT પાથવે અને AJ સ્થિરતા વચ્ચેનો સંબંધ અસ્પષ્ટ છે.
અમે અગાઉ SPECC1L ને બે લોકોમાં પ્રથમ મ્યુટન્ટ જનીન તરીકે ઓળખી કાઢ્યું હતું જેમાં ગંભીર ફાટ હોય છે જે મોંથી આંખ સુધી વિસ્તરે છે, જેને ઓબ્લિક ક્લેફ્ટ (ObFC) અથવા ટેસિયર IV18 ક્લેફ્ટ તરીકે ઓળખવામાં આવે છે.SPECC1L મ્યુટેશન ઓટોસોમલ ડોમિનેન્ટ ઓપિટ્ઝ G/BBB સિન્ડ્રોમ (OMIM #145410) ધરાવતા બે બહુ-જનરેશનલ પરિવારોમાં ઓળખવામાં આવ્યા છે, જેમાં અસરગ્રસ્ત વ્યક્તિઓએ હાઈપરડિસ્ટન્સ અને ક્લેફ્ટ લિપ/પેલેટ19 દર્શાવ્યું હતું, અને ટિબી ઓવરડિસ્ટન્સ સિન્ડ્રોમ ધરાવતા એક પરિવારમાં (OMIM #14545) .Opitz G/BBB સિન્ડ્રોમના અડધાથી વધુ કેસો X-લિંક્ડ (OMIM #300000) છે અને MID1 જનીનમાં પરિવર્તનને કારણે થાય છે, જે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ-સંબંધિત કોષના હાડપિંજરના પ્રોટીન 22ને એન્કોડ કરે છે.અમે અનુમાન કરીએ છીએ કે SPECC1L, માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ અને એક્ટિન સાયટોસ્કેલેટન સાથે સંકળાયેલ પ્રોટીન પણ, કોષ સંલગ્નતા અને સ્થળાંતર 18 દરમિયાન એક્ટિન સાયટોસ્કેલેટન રિમોડેલિંગ માટે જરૂરી સિગ્નલિંગમાં મધ્યસ્થી કરી શકે છે.ઇન વિટ્રો અને વિવો અભ્યાસ દ્વારા, અમે હવે PI3K-AKT સિગ્નલિંગ દ્વારા AJ સ્થિરતાના નવલકથા નિયમનકાર તરીકે SPECC1Lનું વર્ણન કરીએ છીએ.સેલ્યુલર સ્તરે, SPECC1L ની ઉણપને પરિણામે પાન-એકેટી પ્રોટીનના સ્તરમાં ઘટાડો થયો અને AJ ના એપિકલ-બેઝલ વિક્ષેપમાં વધારો થયો, જે AKT પાથવેના રાસાયણિક સક્રિયકરણ દ્વારા દૂર કરવામાં આવ્યો.વિવોમાં, Specc11-ઉણપવાળા એમ્બ્રોયો અશક્ત ન્યુરલ ટ્યુબ બંધ અને CNCC ડિસેક્શનમાં ઘટાડો દર્શાવે છે.આમ, ચહેરાના મોર્ફોજેનેસિસ દરમિયાન સામાન્ય CNCC કાર્ય માટે જરૂરી અત્યંત નિયંત્રિત સેલ એડહેસન-આધારિત સિગ્નલિંગમાં SPECC1L કાર્ય કરે છે.
સેલ્યુલર સ્તરે SPECC1L ની ભૂમિકાને દર્શાવવા માટે, અમે SPECC1L18 માં અગાઉ વર્ણવેલ સ્થિર ઓસ્ટિઓસારકોમા સેલ લાઇન U2OS ની ખામીનો ઉપયોગ કર્યો છે.SPECC1L (kd) નોકડાઉન સાથેના આ સ્થિર U2OS કોષોમાં SPECC1L ટ્રાંસ્ક્રિપ્ટ્સ અને પ્રોટીનના સ્તરોમાં મધ્યમ (60-70%) ઘટાડો થયો હતો, સાથે સાથે એક્ટિન સાયટોસ્કેલેટન 18 ના સ્થળાંતર અને પુનર્ગઠનમાં ખામીઓ હતી. તેનાથી વિપરીત, ગંભીર ક્ષણિક ઘટાડો SPECC1L એ મિટોટિક ખામીઓ તરફ દોરી જતું દર્શાવવામાં આવ્યું છે 23.વધુ પાત્રાલેખન પર, અમને જાણવા મળ્યું કે અમારા સ્થિર SPECC1L-kd કોષોએ ખૂબ ઊંચા સંગમ પર મોર્ફોલોજી બદલ્યું છે (આકૃતિ 1).નીચા સંગમ પર વ્યક્તિગત નિયંત્રણ કોષો અને kd કોષો સમાન દેખાતા હતા (આકૃતિ 1A,D).ફ્યુઝનના 24 કલાક પછી, નિયંત્રણ કોષોએ તેમનો ઘન આકાર જાળવી રાખ્યો (ફિગ. 1B, E), જ્યારે SPECC1L-kd કોષો વિસ્તરેલ (ફિગ. 1C, F).કોષના આકારમાં આ ફેરફારની હદ કંટ્રોલ કોષો અને kd કોશિકાઓ (મૂવી 1) ની વિવો લાઇવ ઇમેજિંગ દ્વારા લેવામાં આવી હતી.સંગમિત કોષોમાં SPECC1L ની ભૂમિકા નક્કી કરવા માટે, અમે પ્રથમ તેની અભિવ્યક્તિની તપાસ કરી.અમે જોયું કે SPECC1L પ્રોટીનનું સ્તર ફ્યુઝન (આકૃતિ 1G) પર વધ્યું છે, જ્યારે SPECC1L ટ્રાન્સક્રિપ્ટ સ્તર વધ્યું નથી (આકૃતિ 1H).વધુમાં, જેમ જેમ કોષની ઘનતા વધી છે તેમ, SPECC1L પ્રોટીન આંતરકોષીય સીમાઓ (ફિગ. 2A-E) પર સંચિત થાય છે, જેમાં પટલ-સંબંધિત β-કેટેનિન (ફિગ. 2A'-E') ની પેટર્ન ઓવરલેપ થાય છે.એક્ટિન સાયટોસ્કેલેટન 18,23 સાથે SPECC1L ના જોડાણને જોતાં અમે અનુમાન કર્યું કે SPECC1L એક્ટિન-આધારિત એડહેસિવ જંકશન (AJ) સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે.
(AF) SPECC1L નોકડાઉન (DF) કોષો નિયંત્રણ U2OS કોષો (AC) ની તુલનામાં ઉચ્ચ સંગમ (F) પર વિસ્તરે છે.અહીં છ ટાઈમ પોઈન્ટ્સ (T1, T3, T6) માંથી ત્રણ બતાવ્યા છે જે અમે વિવિધ સેલ ડેન્સિટી માટે પસંદ કર્યા છે.(G) વેસ્ટર્ન બ્લોટ વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે SPECC1L પ્રોટીન કંટ્રોલ કોશિકાઓમાં નીચા ડિગ્રીના સંગમની તુલનામાં સંગમની ઉચ્ચ ડિગ્રી પર સ્થિર થાય છે.SPECC1L નો વેસ્ટર્ન બ્લોટ અપેક્ષિત 120 kDa બેન્ડ અને ઉચ્ચ મોલેક્યુલર વેઇટ બેન્ડ દર્શાવે છે, સંભવતઃ અનુવાદ પછી સંશોધિત (*).નીચા અને ઉચ્ચ સંગમ માટે સમાન પરિસ્થિતિઓ હેઠળ પશ્ચિમી બ્લોટ વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.નીચા અને ઉચ્ચ સંગમ પર SPECC1L દર્શાવતી છબીઓ સમાન બ્લૉટમાંથી લેવામાં આવી હતી.એ જ ડાઘ દૂર કરવામાં આવ્યો હતો અને β-એક્ટિન એન્ટિબોડી સાથે ફરીથી તપાસ કરવામાં આવી હતી.(H) જથ્થાત્મક RT-PCR પૃથ્થકરણે SPECC1L ટ્રાન્સક્રિપ્ટ સ્તરોમાં કોઈ નોંધપાત્ર ફેરફારો દર્શાવ્યા નથી.ભૂલ બાર ચાર સ્વતંત્ર પ્રયોગોમાંથી SEM રજૂ કરે છે.
(AE) અમે SPECC1L નોકડાઉન (kd) સાથે સેલ આકાર વિશ્લેષણ અને U2OS કોષોમાં AJ ફેરફારોને સામાન્ય બનાવવા માટે સેલ ડેન્સિટીની શ્રેણીનું પ્રતિનિધિત્વ કરતા છ ટાઈમ પોઈન્ટ્સ (T1-T6) પસંદ કર્યા છે.આ સમયના પ્રથમ પાંચ મુદ્દાઓમાં સિંગલ કોષો (T1), નાના કોષોના ક્લસ્ટર્સ (T2) નું 50-70% ફ્યુઝન, kd કોષો (T3) ને ફરીથી આકાર આપ્યા વિના ફ્યુઝન, kd કોષોને ફરીથી આકાર આપવો (T4) અને 24 કલાકના ફેરફારોનો સમાવેશ થાય છે.kd (T5) કોષોના પશ્ચાદવર્તી સ્વરૂપમાં.SPECC1L પ્રોટીન મુખ્યત્વે T1 (A) પર સાયટોપ્લાઝમમાં વિખરાયેલું હતું, પરંતુ તેનું સંચય અનુગામી સમય બિંદુઓ (B–E, તીર) પર આંતરકોષીય સીમાઓ પર જોવા મળ્યું હતું.(FJ) β-કેટેનિન એજે કોમ્પ્લેક્સ સાથે સંકળાયેલ આંતરસેલ્યુલર સીમાઓ પર સમાન સંચય દર્શાવે છે.(A'-E') SPECC1L અને β-કેટેનિન ઉચ્ચ કોષ ઘનતા (તીર) પર કોષની સરહદો પર ઓવરલેપિંગ સ્ટેનિંગ દર્શાવે છે.(F'-J') SPECC1L-kd કોષોમાં, β-કેટેનિન સ્ટેનિંગ ઓછી કોષ ઘનતા (F'-H') પર સામાન્ય દેખાય છે, પરંતુ કોષના આકારમાં ફેરફાર (I', J'; તીરો) તરીકે વિસ્તરે છે, જે દર્શાવે છે કે AJ બદલાઈ ગયા છે.બાર = 10 µm.
અમે પછી AJ પર SPECC1L ની ઉણપની અસર નક્કી કરવાનો પ્રયાસ કર્યો.અમે ઘણા AJ-સંબંધિત માર્કર્સનો ઉપયોગ કર્યો, જેમાં પ્રમાણભૂત ઘટકો F-actin, myosin IIb, β-catenin અને E-cadherin24,25,26,27નો સમાવેશ થાય છે.અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ SPECC1L-kd કોષોમાં એક્ટિન સ્ટ્રેસ ફાઇબર્સ વધ્યા છે (ફિગ. 3A,B) 18.એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સ સાથે સંકળાયેલ માયોસિન IIb એ વિટ્રોમાં SPECC1L-kd કોષોમાં સમાન વધારો દર્શાવ્યો હતો (ફિગ. 3C,D).AJ-સંબંધિત β-catenin કોષ પટલમાં કેડરિન સાથે જોડાય છે, જે કંટ્રોલ ક્યુબોસાઇટ્સમાં સામાન્ય "હનીકોમ્બ" અભિવ્યક્તિ પેટર્ન દર્શાવે છે (ફિગ. 3E,G).રસપ્રદ વાત એ છે કે, કોન્ફોકલ માઈક્રોસ્કોપીનો ઉપયોગ કરીને ફ્લેટ ઈમેજીસમાં, β-કેટેનિન (ફિગ. 3E,F) અને E-cadherin (Fig. 3G,H) સંગમિત SPECC1L-ની ઉણપવાળા કોષોના કોષ પટલ પર સ્ટેનિંગ વિસ્તૃત સ્ટેનિંગની અગ્રણી પેટર્ન દર્શાવે છે.kd કોશિકાઓમાં AJ-સંબંધિત β-catenin સ્ટેનિંગનું આ વિસ્તરણ સંગમ સમયે સૌથી વધુ સ્પષ્ટ હતું, પરંતુ કોષના આકારમાં ફેરફારો પહેલા દેખાય છે (ફિગ. 2F-J, F'-J').આ વિસ્તૃત AJ સ્ટેનિંગની ભૌતિક પ્રકૃતિ નક્કી કરવા માટે, અમે ટ્રાન્સમિશન ઈલેક્ટ્રોન માઈક્રોસ્કોપી (TEM) (આકૃતિ 3I,J) દ્વારા SPECC1L-kd U2OS કોષોની apical-basal સપાટી પર સેલ બોર્ડર્સની તપાસ કરી.નિયંત્રણ કોશિકાઓ (ફિગ. 3I), જે AJ (તીર) ના સૂચક અલગ ઇલેક્ટ્રોન ગાઢ પ્રદેશો ધરાવતા હતા તેનાથી વિપરીત, kd કોષો (ફિગ. 3J) એપીકોબાસલ પ્લેન સાથે AJ ના ઉચ્ચ ઇલેક્ટ્રોન ઘનતા સૂચક વિશાળ, સંલગ્ન પ્રદેશો દર્શાવે છે..વધુમાં, ટ્રાંસવર્સ વિભાગો પર, અમે kd કોષો (ફિગ. S1A,B) માં વ્યાપક કોષ પટલના ફોલ્ડ્સનું અવલોકન કર્યું, જે β-કેટેનિન અને E-cadherin સ્ટેનિંગ બેન્ડ્સ (ફિગ. 3F,H) ની વિસ્તૃત પેટર્ન સમજાવે છે.AJs માં SPECC1L ની ભૂમિકાના સમર્થનમાં, β-catenin સંગમિત U2OS કોશિકાઓ (ફિગ. 3K) ના lysates માં SPECC1L સાથે સહ-રોગપ્રતિકારક હતી.AJ માર્કર્સ માટે વિસ્તૃત ઇમ્યુનોસ્ટેનિંગ સાથે, TEM વિશ્લેષણ અમારી પૂર્વધારણા સાથે સુસંગત હતું કે SPECC1L ની ઉણપ AJ apical-basal ગીચતા અને ભિન્નતામાં વધારો કરે છે.
(AH) 48 કલાક પોસ્ટ-ફ્યુઝન (T6; A, B) પર kd કોષોમાં F-actin સ્ટેનિંગમાં વધારો.F-actin (C, D) સાથે સંકળાયેલ myosin IIb ના બદલાયેલ સ્ટેનિંગ.SPECC1L-kd (F, H) કોષોમાં નિયંત્રણ કોષો (E, G) માં β-catenin અને E-cadherin મેમ્બ્રેન સ્ટેનિંગની સરળ પેટર્ન વધારવામાં આવી હતી.બાર = 10 µm.(I-J) એપિકલ-બેઝલ ઇન્ટરસેલ્યુલર જંકશનનું નિરીક્ષણ કરતા ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોગ્રાફ્સ.કંટ્રોલ કોષો અલગ ઇલેક્ટ્રોન-ગીચ પ્રદેશો દર્શાવે છે જે સ્ટીકી જંકશન (I, એરો) દર્શાવે છે.તેનાથી વિપરિત, SPECC1L-kd કોષોમાં સમગ્ર એપિકલ-બેઝલ જંકશન ઇલેક્ટ્રોન ડેન્સ (J, એરોઝ) દેખાયા હતા, જે એડહેસિવ જંકશનની વધેલી ઘનતા અને વિખેરીને દર્શાવે છે.(K) β-catenin સંગમિત U2OS સેલ લાઇસેટ્સમાં SPECC1L સાથે સહ-રોગપ્રતિકારક હતી.ચાર સ્વતંત્ર પ્રયોગોમાંથી એકનું પ્રતિનિધિત્વ કરતી એક જગ્યાએથી લીધેલી છબી.
ક્રેનિયોફેસિયલ મોર્ફોજેનેસિસમાં SPECC1L ની ભૂમિકાને સમજવા માટે, અમે બે સ્વતંત્ર ES ટ્રેપ સેલ લાઇન્સ, DTM096 અને RRH048 (BayGenomics, CA) નો ઉપયોગ કરીને Specc1l ખામીયુક્ત માઉસ મોડેલ બનાવ્યું છે, જે ઇન્ટ્રોન 1 અને Specc1l ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ F15 (F15) પર કેપ્ચર કરવામાં આવ્યા હતા. .4A, આકૃતિ S2).ડિકોય વેક્ટર ઇન્સર્ટનું જિનોમિક સ્થાન સમગ્ર જિનોમ સિક્વન્સિંગ દ્વારા નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું અને PCR (ફિગ. S2) દ્વારા પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી.બંને જનીન ટ્રેપ ડિઝાઇને કેપ્ચર કર્યા પછી સ્પેક11-લાકઝેડ રિપોર્ટરોના ઇન-ફ્રેમ ફ્યુઝનને પણ મંજૂરી આપી હતી.તેથી, X-gal સ્ટેનિંગ દ્વારા નિર્ધારિત lacZ અભિવ્યક્તિનો ઉપયોગ Specc11 અભિવ્યક્તિના સૂચક તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો.ઇન્ટ્રોન 1 માં DTM096 જનીન ટ્રેપ ઇન્ટ્રોન 15 માં RRH048 કરતાં વધુ મજબૂત અભિવ્યક્તિ દર્શાવે છે (બતાવેલ નથી).જો કે, E8.5 (આકૃતિ 4B), ન્યુરલ ટ્યુબમાં અને E9.5 અને E10.5 (આકૃતિ 4C,D) પર ચહેરાની પ્રક્રિયાઓમાં અને વિકાસશીલ અંગોમાં, ખાસ કરીને મજબૂત અભિવ્યક્તિ સાથે, સ્પેક1l વ્યાપકપણે વ્યક્ત થાય છે. E10 પર.5 અને આંખો (આકૃતિ 4D).અમે અગાઉ જાણ કરી હતી કે E10.5 ખાતે પ્રથમ ફેરીન્જિયલ કમાનમાં SPECC1L અભિવ્યક્તિ એપિથેલિયમ અને અંતર્ગત મેસેનચાઇમ 18 માં હાજર હતી, જે CNCC વંશ સાથે સુસંગત છે.CNCC માં SPECC1L અભિવ્યક્તિ ચકાસવા માટે, અમે E8.5 ન્યુરલ ફોલ્ડ્સ (આકૃતિ 4E-J) અને E9.5 ખોપરીના વિભાગો (આકૃતિ 4K-) કર્યા.E8.5 પર, SPECC1L સ્ટેઇન્ડ ન્યુરલ ફોલ્ડ્સ તીવ્રતાથી (ફિગ. 4E, H), જેમાં NCC માર્કર્સ (ફિગ. 4G, J) સાથે ડાઘવાળા કોષોનો સમાવેશ થાય છે.E9.5 પર, SPECC1L (Fig. 4K, N) AP2A (ફિગ. 4L, M) અથવા SOX10 (ફિગ. 4O, P) સાથે સહ-સ્ટેઇન્ડ સ્થાનાંતરિત CNCC મજબૂત સ્ટેઇન્ડ.
(A) ES DTM096 (ઇન્ટ્રોન 1) અને RRH048 (ઇન્ટ્રોન 15) સેલ ક્લોનમાં ડેકોય વેક્ટર ઇન્સર્ટેશન દર્શાવતું માઉસ Specc11 જનીનનું યોજનાકીય રજૂઆત.(BD) E8.5 થી E10.5 સુધી Specc1l અભિવ્યક્તિનું પ્રતિનિધિત્વ કરતા હેટરોઝાયગસ Specc1lDTM096 એમ્બ્રોયોનું lacZ સ્ટેનિંગ.NE = neuroectoderm, NF = ન્યુરલ ફોલ્ડ, PA1 = પ્રથમ ફેરીન્જિયલ કમાન.(EP) E8.5 (NF; EJ) ન્યુરલ ફોલ્ડ્સ અને E9.5 (KP) ખોપરીના વિભાગોમાં NCC માર્કર્સ AP2A અને SOX10 સાથે SPECC1L ઇમ્યુનોસ્ટેનિંગ.AP2A (F, G; એરોહેડ્સ) અને SOX10 (I, J; એરોહેડ્સ) સાથે લેબલ કરેલા કોષો સહિત, ન્યુરલ ફોલ્ડ્સ E8.5 (E, H; એરોહેડ્સ) માં SPECC1L સ્ટેનિંગ વ્યાપકપણે જોવા મળ્યું હતું.E9.5 પર, SPECC1L એ AP2A (L, M; તીરો) અને SOX10 (O, P; તીરો) લેબલવાળા સ્થાનાંતરિત CNCCs (K, N; તીરો) ને મજબૂત રીતે સ્ટેઇન્ડ કર્યું.
હેટરોઝાયગસ Specc1lDTM096/+ અને Specc1lRRH048/+ ઉંદર વચ્ચેનું ક્રોસિંગ બતાવે છે કે બે જનીન ટ્રેપ એલીલ્સ પૂરક નથી અને તે સંયોજન હેટરોઝાયગોટ્સ અને એમ્બ્રોનિક હોમોઝાયગોટ્સ કોઈપણ જનીન ટ્રેપ એલીલ માટે ગર્ભ ઘાતક છે (કોષ્ટક S1).મેન્ડેલિયન રેશિયો જન્મ સમયે હેટરોઝાયગોટ્સના અસ્તિત્વ દરમાં ઘટાડો દર્શાવે છે (અપેક્ષિત 1.34 વિ. 2.0).અમે હેટરોઝાયગોટ્સમાં ઓછી પેરીનેટલ મૃત્યુદર નોંધ્યું, કેટલાકમાં ક્રેનિયોફેસિયલ વિસંગતતાઓ હતી (ફિગ. S3).જો કે, આ પેરીનેટલ ક્રેનિયોફેસિયલ ફેનોટાઇપ્સની ઓછી ઘૂંસપેંઠ તેમના અંતર્ગત પેથોફિઝીયોલોજીકલ મિકેનિઝમ્સનો અભ્યાસ કરવાનું મુશ્કેલ બનાવે છે.તેથી, અમે હોમોઝાઇગસ સ્પેક 11 મ્યુટન્ટ્સના ગર્ભ ઘાતક ફેનોટાઇપ પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કર્યું.
મોટાભાગના સંયોજન હેટરોઝાઇગસ અથવા હોમોઝાઇગસ સ્પેક1lDTM096/RRH048 મ્યુટન્ટ એમ્બ્રોયો E9.5–10.5 (ફિગ્સ. 5A–D) પછી વિકસિત થયા ન હતા, અને ન્યુરલ ટ્યુબ આગળથી બંધ થતી ન હતી (ફિગ્સ. 5B, D) અને કેટલીકવાર પાછળથી બંધ થતી હતી (બતાવ્યા નથી) ..આ ક્રેનિયલ ન્યુરલ ટ્યુબ ક્લોઝર ખામી E10.5 પર ન્યુરલ ફોલ્ડ્સમાં બાકી રહેલા મોટાભાગના CNCC ચિહ્નિત DLX2 સાથે સંકળાયેલી હતી, જે કોઈ ડિસેક્શન નથી (આકૃતિ 5A'-D') સૂચવે છે.CNCC નું એકંદર કદ પણ ઘટાડવામાં આવ્યું હતું કે કેમ તે નિર્ધારિત કરવા માટે, અમે Wnt1-Cre અને ROSAmTmG સાથે અમારી જીન ટ્રેપ લાઇનમાં GFP સાથે CNCC લાઇનને ટેગ કર્યા છે.અમે સમગ્ર ગર્ભમાંથી સૉર્ટ કરેલ GFP+ NCC અને GFP- (RFP+) નોન-NCC સ્ટ્રીમ કરીએ છીએ.E9.5 પર, WT અને મ્યુટન્ટ એમ્બ્રોયો વચ્ચે ફ્લો-સૉર્ટ કરેલ GFP-લેબલવાળા CNCC નું પ્રમાણ નોંધપાત્ર રીતે બદલાયું નથી (બતાવેલ નથી), જે સામાન્ય CNCC સ્પષ્ટીકરણ સૂચવે છે.તેથી, અમે અનુમાન કર્યું કે ખુલ્લા ન્યુરલ ફોલ્ડ્સ (આકૃતિ 5B') માં શેષ Wnt1-Cre અને DLX2 સ્ટેનિંગ ખામીયુક્ત CNCC લેયરિંગને કારણે છે, સંભવતઃ SPECC1L-kd કોશિકાઓમાં જોવાયા પ્રમાણે, AJ કોષોની વધેલી ઘનતા અથવા ફેલાવાને કારણે.ન્યુરલ ફોલ્ડ (આકૃતિ 5E-R) માં CNCC ની હાજરીની પુષ્ટિ કરવા માટે અમે NCC માર્કર્સ SOX10, AP2A અને DLX2 નો ઉપયોગ કર્યો.E8.5 પર, WT (Fig. 5E, G, I) અને Specc1l મ્યુટન્ટ (ફિગ. 5F, H, J) ના વિભાગોમાં ત્રણેય NCC માર્કર્સ માટે ન્યુરલ ફોલ્ડ સ્ટેનિંગ જોવા મળ્યું હતું.E9.5 પર, જ્યારે NCC માર્કર્સ WT વિભાગોમાં સ્થાનાંતરિત NCC સ્ટેન કરે છે (ફિગ. 5M, O, Q), શેષ NCC સ્ટેનિંગ Specc1l મ્યુટન્ટ એમ્બ્રોયો (ફિગ. 5N, P, R) ના ખુલ્લા ન્યુરલ ફોલ્ડ્સમાં જોવા મળ્યું હતું.કારણ કે SOX10 અને DLX2 CNCC ને સ્થાનાંતરિત કરે છે, આ પરિણામ સૂચવે છે કે SPECC1L-ઉણપ ધરાવતા CNCC પોસ્ટ-માઇગ્રેટરી સ્પષ્ટીકરણ પ્રાપ્ત કરે છે પરંતુ ન્યુરલ ફોલ્ડ્સમાંથી સ્થાનાંતરિત કરવામાં નિષ્ફળ જાય છે.
Specc11 ની ઉણપ ખામીયુક્ત ન્યુરલ ટ્યુબ બંધ, ક્રેનિયલ ન્યુરલ ક્રેસ્ટ કોશિકાઓ અને AJsનું વિઘટન તરફ દોરી જાય છે.
(A, B') E9.5 WT (A) સ્થાનાંતરિત ક્રેનિયલ ન્યુરલ ક્રેસ્ટ કોશિકાઓ (CNCC) વહન કરતો ગર્ભ Wnt1-Cre (A') સાથે લેબલ થયેલ છે.તેનાથી વિપરીત, Specc11 મ્યુટન્ટ એમ્બ્રોયો ઓપન ન્યુરલ ફોલ્ડ્સ (B), એરોહેડ્સ) અને CNCCs કે જે સ્થાનાંતરિત થયા નથી (B', એરોહેડ્સ) દર્શાવે છે.(C, D') E10.5 WT એમ્બ્રોયો (C, C') અને Specc1l (D, D') ના CNCC માર્કર DLX2 ની તેજસ્વી ક્ષેત્રની છબીઓ (C, D') અને ઇમ્યુનોસ્ટેનિંગ (C', D').WT E10.5 એમ્બ્રોયોમાં, DLX2-પોઝિટિવ CNCC ગિલ કમાનો (C', તીર) ને વસાહત બનાવે છે, જ્યારે મ્યુટન્ટ્સમાં, ખુલ્લા ન્યુરલ ફોલ્ડ્સ (D', તીર) અને પ્રથમ ફેરીન્જિયલ કમાનો (D',) માં સ્પષ્ટ સ્ટેનિંગ ચાલુ રહે છે. તીર).) કેટલાક સ્ટેનિંગ (તીરો) સાથે જે નબળા ડિલેમિનેશન અને સીએનસીસીનું સ્થળાંતર સૂચવે છે.ER) E8.5 (E–L) અને E9.5 (M–R) તબક્કામાં WT અને Specc1l મ્યુટન્ટ એમ્બ્રોયોના વિભાગોને NCC માર્કર્સ SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H,) સાથે લેબલ કરવામાં આવ્યા હતા. O, P ) અને DLX2 (I, J, Q, R).E8.5 પર, NCC સ્ટેનિંગ જંગલી પ્રકારના ન્યુરલ ફોલ્ડ (NF) અને મ્યુટન્ટ વિભાગોમાં જોવા મળ્યું હતું.E8.5 WT (K) અને મ્યુટન્ટ (L) માં SOX10 અને β-કેટેનિનના સહ-સ્ટેનિંગથી ન્યુરલ ફોલ્ડ્સમાં કોષની સીમાઓ પર β-કેટેનિન સ્ટેનિંગમાં વધારો થયો છે.E9.5 પર, સ્થળાંતર કરનારા CNCCs (M, O, Q) નું જંગલી પ્રકારનું સ્ટેનિંગ જોવા મળ્યું હતું, જ્યારે મ્યુટન્ટ્સમાં, અસ્તરિત CNCC એ ખુલ્લા ન્યુરલ ફોલ્ડ્સ (N, P, R) સ્ટેઇન્ડ કર્યા હતા.(S–Z) E9.5 પરિવર્તન સાથે WT અને Specc11DTM096/RRH048 એમ્બ્રોયોના કોરોનલ વિભાગોમાં વિવો એજે લેબલીંગ વિશ્લેષણમાં.ઉપલા જમણા ખૂણામાં અંદાજિત વિભાગીય પ્લેન બતાવવામાં આવ્યું છે.મ્યુટન્ટ પેશીઓના વિભાગોમાં, F-actin (S, T) અને myosin IIb (U, V) ના વધેલા સ્ટેનિંગ જોવા મળ્યા હતા.ફિગ. 3 માં વિટ્રો પરિણામોની જેમ, મ્યુટન્ટ એમ્બ્રોયોમાં, β-કેટેનિન (W, X) અને E-cadherin (Y, Z) માટે ઉન્નત પટલ સ્ટેનિંગ જોવા મળ્યું હતું.(AA-BB) એપિકલ-બેઝલ કોષની સરહદની બહાર જોતા જંગલી-પ્રકારના ગર્ભના એક વિભાગનો ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોગ્રાફ એડહેસિવ જંકશન (AA, તીર) નું સૂચક એક અલગ ઇલેક્ટ્રોન-ગીચ પ્રદેશ દર્શાવે છે.તેનાથી વિપરિત, Specc11 મ્યુટન્ટ એમ્બ્રોયો (BB, તીર) ના વિભાગોમાં, સમગ્ર એપીકોબાસલ જંકશન ઇલેક્ટ્રોન ગાઢ છે, જે એડહેસિવ જંકશનની વધેલી ઘનતા અને વિક્ષેપ દર્શાવે છે.
અમારી ધારણાને ચકાસવા માટે કે લેયરિંગમાં ઘટાડો બદલાયેલ AJ ને કારણે થયો છે, અમે Specc1l મ્યુટન્ટ એમ્બ્રોયો (ફિગ. 5S-Z) ના ખુલ્લા ન્યુરલ ફોલ્ડ્સમાં AJ લેબલિંગની તપાસ કરી.અમે એક્ટિન સ્ટ્રેસ ફાઇબર્સમાં વધારો (ફિગ. 5S, T) અને એક્ટિન ફાઇબર (ફિગ. 5U, V) પર માયોસિન IIB સ્ટેનિંગના સ્થાનિકીકરણમાં વધારો જોયો છે.મહત્ત્વપૂર્ણ રીતે, અમે ઇન્ટરસેલ્યુલર સીમાઓ પર β-કેટેનિન (ફિગ. 5W,X) અને E-cadherin (Fig. 5Y,Z) ના વધેલા સ્ટેનિંગનું અવલોકન કર્યું.અમે E8.5 એમ્બ્રોયો (ફિગ. 5K, L) ના ન્યુરલ ફોલ્ડ્સમાં એનસીસીના β-કેટેનિન સ્ટેનિંગની પણ તપાસ કરી.Specc1l મ્યુટન્ટ ન્યુરલ ફોલ્ડ્સ (ફિગ. 5L અને K) માં β-કેટેનિન સ્ટેનિંગ વધુ મજબૂત દેખાય છે, જે સૂચવે છે કે AJ ફેરફારો શરૂ થયા છે.E9.5 એમ્બ્રોયોના ખોપરીના વિભાગોના ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોગ્રાફ્સમાં, અમે ફરીથી WT (ફિગ. 5AA, BB અને S1E-H) ની તુલનામાં Specc1l મ્યુટન્ટ એમ્બ્રોયોમાં ફેલાયેલા ઇલેક્ટ્રોન-ગાઢ સ્ટેનિંગનું અવલોકન કર્યું.એકસાથે લેવામાં આવે તો, આ પરિણામો SPECC1L-kd U2OS કોષોમાં અમારા ઇન વિટ્રો પરિણામોને સમર્થન આપે છે અને સૂચવે છે કે અસ્પષ્ટ AJ સ્ટેનિંગ અમારા મ્યુટન્ટ એમ્બ્રોયોમાં CNCC સ્તરીકરણની પહેલાં છે.
AKT પ્રવૃત્તિ અને E-cadherin સ્થિરતા વચ્ચેના જાણીતા વિરોધી સંબંધને જોતાં, 17,28 અમે PI3K-AKT સિગ્નલિંગની સંડોવણીની ધારણા કરી.વધુમાં, અમે અમારા કેટલાક મ્યુટન્ટ એમ્બ્રોયોમાં સબએપીડર્મલ ફોલ્લાઓ જોયા જે E9.5-10.5 પર ઘાતકતા (<5%)થી બચી ગયા અને તેના બદલે E13.5 (ફિગ. S3) પર સ્થાયી થયા.સબપીડર્મલ વેસિકલ્સ એ PDGFRα12 પર આધારિત PI3K-AKT સિગ્નલિંગના ઘટાડાની ઓળખ છે.ફેન્ટાઉઝો એટ અલ.(2014) અહેવાલ આપ્યો છે કે PdgfraPI3K/PI3K મ્યુટન્ટ એમ્બ્રોયોમાં PDGFRα-આધારિત PI3K સક્રિયકરણમાં વિક્ષેપ સબએપીડર્મલ વેસિકલ્સ, ન્યુરલ ટ્યુબ ખામી અને ક્લેફ્ટ પેલેટ ફેનોટાઇપ્સમાં પરિણમે છે.ખરેખર, Specc1l મ્યુટન્ટ પેશીઓમાં વિવોમાં પાન-એકેટી અને સક્રિય ફોસ્ફોરીલેટેડ સેર473-એકેટીનું સ્તર ઘટાડીને E9.5 ગર્ભની ધરપકડ (ફિગ. 6A-D) કરવામાં આવ્યું હતું.ફોસ્ફોરીલેટેડ Ser473-AKT ના સ્તરોમાં ઘટાડો સંપૂર્ણપણે વિવો (FIG. 6E) અને ઇન વિટ્રો (FIG. 6F) માં પાન-એકેટીના સ્તરોમાં ઘટાડો થવાને કારણે હોઈ શકે છે.ઇન વિટ્રો ઘટાડો ત્યારે જ જોવા મળ્યો જ્યારે U2OS કોષો કોષના આકાર અને AJ ઘનતા (આકૃતિ 6D) માં ફેરફારો સાથે મજબૂત રીતે સંમિશ્રિત હતા.આમ, અમારો ડેટા સૂચવે છે કે SPECC1L એ ક્રેનિયોફેસિયલ મોર્ફોજેનેસિસમાં PI3K-AKT સિગ્નલિંગનું નવલકથા હકારાત્મક નિયમનકાર છે.
(A-E) E8.5 (A,B) અને E9.5 (C,D) ખોપરીના વિભાગો અથવા E9.5 lysates માંથી Specc1l મ્યુટન્ટ એમ્બ્રોયો (E) સક્રિય ફોસ્ફોરીલેટેડ S473-AKT અને પાન-AKT પ્રોટીન ઘટાડોનું સ્તર દર્શાવે છે , નિયંત્રણ WT ની સરખામણીમાં.વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ જંગલી પ્રકારના લિસેટ્સ અને મ્યુટન્ટ લિસેટ્સ પર સમાન શરતો હેઠળ કરવામાં આવ્યું હતું.SPECC1L માટે બતાવેલ છબીઓ એક બ્લૉટમાંથી લેવામાં આવી હતી.એ જ ડાઘ દૂર કરવામાં આવ્યો હતો અને એન્ટિ-પાન-એસીટી અને β-એક્ટિન એન્ટિબોડીઝ સાથે ફરીથી તપાસ કરવામાં આવી હતી.E8.5 ન્યુરલ ફોલ્ડ્સ (A, B) માં પાન-AKT સ્તરો અને E9.5 ખોપરીના વિભાગોમાં ફોસ્ફોરીલેટેડ S473-AKT ના સ્તરો નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડી દેવામાં આવ્યા હતા.(F) ઉચ્ચ સંગમ પર લણણી કરાયેલ SPECC1L-kd U2OS કોશિકાઓના લિસેટ્સમાં પાન-એકેટી સ્તર સમાન રીતે ઘટાડવામાં આવ્યા હતા.એરર બાર ત્રણ સ્વતંત્ર વેસ્ટર્ન બ્લૉટ ક્વોન્ટિફિકેશનમાંથી SEM ને રજૂ કરે છે.(GJ) WT એમ્બ્રોયોના E9.5 પરના વિભાગો અનુક્રમે KI67 અને ક્લીવ્ડ કેસ્પેસ 3 થી ડાઘાવાળું છે, જે કોષ પ્રસાર (G, G') અને થોડી એપોપ્ટોટિક પ્રવૃત્તિ (H, H') દર્શાવે છે.Specc11 મ્યુટન્ટ એમ્બ્રોયો તુલનાત્મક કોષ પ્રસાર (I) દર્શાવે છે, પરંતુ એપોપ્ટોસિસમાંથી પસાર થતા કોષોની સંખ્યામાં નોંધપાત્ર વધારો થયો છે (J).
અમે પછી પ્રસાર અને એપોપ્ટોસિસના માર્કર્સની તપાસ કરી.અમે WT મ્યુટન્ટ્સ માટે 82.5% અને KI67 સ્ટેનિંગ (p <0.56, ફિશરના ચોક્કસ પરીક્ષણ).એ જ રીતે, અમે એપોપ્ટોસીસમાં E8.5 પર ન્યુરલ ફોલ્ડ્સમાં ક્લીવ્ડ કેસ્પેસ 3 માટે સ્ટેનિંગ દ્વારા માપવામાં આવેલ એપોપ્ટોસીસમાં કોઈ તફાવત જોયો નથી જ્યાં સુધી એમ્બ્રીયો એરેસ્ટ (બતાવેલ નથી) (બતાવેલ નથી).તેનાથી વિપરીત, તમામ E9.5 મ્યુટન્ટ એમ્બ્રોયો (ફિગ. 6F, H અને J) માં એપોપ્ટોસિસ નોંધપાત્ર રીતે વધ્યો હતો.એપોપ્ટોસિસમાં આ એકંદર વધારો ઘટેલા PI3K-AKT સિગ્નલિંગ અને પ્રારંભિક ગર્ભ ઘાતકતા 29,30,31 સાથે સુસંગત છે.
આગળ, અમારા kd કોષોમાં AJ ફેરફારોમાં PI3K-AKT સિગ્નલિંગ માટે કારણભૂત ભૂમિકાની પુષ્ટિ કરવા માટે, અમે નિયંત્રણ અને kd કોષો (આકૃતિ 7A-F) માં પાથવેને રાસાયણિક રીતે બદલ્યો છે.અમે સંગમિત SPECC1L-kd કોષોમાં જોવા મળેલા કોષના આકાર પરિવર્તન ફેનોટાઇપનો માર્કર તરીકે ઉપયોગ કર્યો છે, જેને અમે અનુરૂપ વર્ટિકલ ડાયમેન્શન (પહોળાઈ) ના સૌથી લાંબા પરિમાણ (લંબાઈ) ના ગુણોત્તરનો ઉપયોગ કરીને પરિમાણ કર્યું છે.પ્રમાણમાં રાઉન્ડ અથવા ક્યુબોઇડલ કોષો (આકૃતિ 7G) માટે 1 નો ગુણોત્તર અપેક્ષિત છે.કોષના આકાર ઉપરાંત, અમે β-કેટેનિન સ્ટેનિંગ (ફિગ. 7A'-F') દ્વારા AJ પરની અસરની પણ પુષ્ટિ કરી છે.વોર્ટમેનિનનો ઉપયોગ કરીને PI3K-AKT પાથવેનું નિષેધ નિયંત્રણ કોષો (આકૃતિ 7A,C) અને AJ (આકૃતિ 7A')માં કોષનો આકાર બદલવા માટે પૂરતો હતો.PI3K-AKT એક્ટિવેટર SC-79 એ નિયંત્રણ કોષોમાં સેલ આકાર (FIG. 7A, E) અથવા AJ વિસ્તરણ (FIG. 7A') ને અસર કરી નથી.SPECC1L-kd કોષોમાં, PI3K-AKT પાથવેના વધુ દમનને પરિણામે એપોપ્ટોસિસમાં વધારો થયો (ફિગ. 7B,D) અને β-કેટેનિન સ્ટેનિંગ (ફિગ. 7B') માં નોંધપાત્ર વધારો થયો, જે આપણા વિવો હેવી મ્યુટન્ટ્સ સાથે સુસંગત છે.મહત્ત્વપૂર્ણ રીતે, PI3K-AKT પાથવેના સક્રિયકરણથી સેલ આકાર (આકૃતિ 7B,F) અને AJ ફેનોટાઇપ્સ (આકૃતિ 7B”)માં નોંધપાત્ર સુધારો થયો છે.કોષના આકારમાં થતા ફેરફારોને સેલ રાઉન્ડનેસ રેશિયો (CCR) તરીકે માપવામાં આવ્યા હતા અને ઉપર વર્ણવ્યા પ્રમાણે મહત્વની સરખામણી કરવામાં આવી હતી (FIG. 7G).ખરેખર, નિયંત્રણ કોશિકાઓમાં (ફિગ. 7G, CCR = 1.56), વોર્ટમેનિન સારવાર કોષના આકારમાં નોંધપાત્ર ફેરફાર કરવા માટે પૂરતી હતી (ફિગ. 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) જે રીતે અવલોકન કરવામાં આવી હતી. SPECC1L માં.-kd કોષો (ફિગ. 7G, CCR = 3.46).SPECC1L-kd કોષોની વોર્ટમેનિન ટ્રીટમેન્ટ (ફિગ. 7G, CCR = 3.60, નગણ્ય) સારવાર ન કરાયેલ kd કોષો (ફિગ. 7G, CCR = 3.46, નગણ્ય) અથવા વોર્ટમેનિન-ટ્રીટેડ કંટ્રોલ કોશિકાઓ (ફિગ. 7G) કરતાં વધુ નોંધપાત્ર ન હતી., CCR = 3.46, નગણ્ય) વધુમાં કોષના વિસ્તરણને અસર કરે છે (7G, CCR = 3.61, નગણ્ય).સૌથી અગત્યનું, SC-79 AKT એક્ટિવેટરે SPECC1L-kd કોષોના વિસ્તરેલ ફિનોટાઇપને પુનઃસ્થાપિત કર્યું (ફિગ. 7G, CCR = 1.74, p < 6.2 × 10-12).આ પરિણામો પુષ્ટિ કરે છે કે SPECC1L PI3K-AKT સિગ્નલિંગનું નિયમન કરે છે અને સૂચવે છે કે SPECC1L માં મધ્યમ ઘટાડો સેલ સંલગ્નતાને અસર કરે છે, જ્યારે મજબૂત ઘટાડો એપોપ્ટોસિસ તરફ દોરી જાય છે (ફિગ. 8).
(A–F') નિયંત્રણ (A, C, E) અને SPECC1L-kd (B, D, F) કોષોની સારવાર PI3K-AKT પાથવે ઇન્હિબિટર વોર્ટમેનિન (C, D) અથવા SC-79 એક્ટિવેટર (E, F) સારવાર સાથે કરવામાં આવે છે. સારવાર ન કરાયેલ નિયંત્રણ કોષો સામાન્ય β-કેટ સેલ્યુલર સ્ટેનિંગ (A') સાથે ક્યુબોઇડલ (A) હોય છે, જ્યારે kd કોષો β-બિલાડીના સ્ટેનિંગ (B') સાથે વિસ્તરેલ (B) હોય છે.PI3K-AKT પાથવેના દમન પછી, નિયંત્રણ કોશિકાઓ β-બિલાડી વિસ્તરણ (C') સાથે વિસ્તરેલ (C), જ્યારે kd કોશિકાઓ એપોપ્ટોસિસ (D)માંથી પસાર થવાનું શરૂ કર્યું, જે આપણા અત્યંત પરિવર્તિત ગર્ભની જેમ અને અત્યંત ઉન્નત β-બિલાડી દર્શાવે છે.સ્ટેનિંગ (D').PI3K-AKT પાથવેના સક્રિયકરણ પછી, નિયંત્રણ કોષો ક્યુબોઇડલ (E) રહ્યા હતા અને સામાન્ય β-cat (E') સ્ટેનિંગ ધરાવતા હતા, જ્યારે kd કોષોએ નોંધપાત્ર રીતે સુધારેલ સેલ આકાર (F) અને β-કેટ (F') સ્ટેનિંગ દર્શાવ્યું હતું, જે દર્શાવે છે. (G) મેટામોર્ફ સૉફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરીને સૌથી લાંબા પરિમાણ (લંબાઈ) ના સેલ રાઉન્ડનેસ રેશિયો (CCR) અને અનુરૂપ વર્ટિકલ ડાયમેન્શન (પહોળાઈ) નો ઉપયોગ કરીને (AF) માં સેલ આકારમાં ફેરફારની ડિગ્રીનું પ્રમાણ નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું.સારવાર ન કરાયેલ (NT) SPECC1L-kd કોષો (CCR = 3.46) નિયંત્રણ કોષો કરતાં નોંધપાત્ર રીતે લાંબા હતા (CCR = 1.56, p < 6.1 × 10–13).નિયંત્રણ કોષોમાં PI3K-AKT પાથવેનું વોર્ટનું નિષેધ કોષના આકારમાં સમાન વિસ્તરણ માટે પૂરતું હતું (CCR=3.61, p<2.4×10-9).એ જ રીતે, SPECC1L-kd કોષોમાં SC-79 દ્વારા AKT સક્રિયકરણે કોષના વિસ્તરણને નિયંત્રણ સ્તરો પર પુનઃસ્થાપિત કર્યું (CCR = 1.74, p < 6.2 × 10–12).SPECC1L-kd કોષોની વોર્ટમેનિન સારવારના પરિણામે એપોપ્ટોસિસમાં વધારો થયો હતો પરંતુ સારવાર ન કરાયેલ kd (CCR=3.46, ns) અથવા વોર્ટમેનિન-ટ્રીટેડ કંટ્રોલ કોષો (3.61) ની સરખામણીમાં કોષના આકારમાં કોઈ વધુ વધારો થયો નથી.ns = વાંધો નથી.+/- 50 કોષો માટે SEM માપ બતાવવામાં આવે છે.વિદ્યાર્થીની ટી-ટેસ્ટનો ઉપયોગ કરીને આંકડાકીય તફાવતોની ગણતરી કરવામાં આવી હતી.
(A) PI3K-AKT પાથવેના નિષેધ અને સક્રિયકરણની યોજનાકીય રજૂઆત અનુક્રમે AJ ફેરફારો અને બચાવમાં પરિણમે છે.(B) SPECC1L દ્વારા AKT પ્રોટીન સ્થિરીકરણ માટે પ્રસ્તાવિત મોડેલ.
પ્રિમિગ્રેટરી CNCC ને અગ્રવર્તી ન્યુરલ ફોલ્ડ ન્યુરોએપિથેલિયલ કોષો 1,15,32 થી અલગ કરવા માટે AJ lysisની જરૂર પડે છે.AJ ઘટકોના સ્ટેનિંગમાં વધારો અને SPECC1L-ઉણપવાળા કોષોમાં apical-basal AJ અસમપ્રમાણ વિતરણની ખોટ, બંને વિટ્રો અને વિવોમાં, SPECC1L ની ભૌતિક નિકટતા સાથે β-catenin, સૂચવે છે કે AJ સ્થાનિક સ્થિરતાને યોગ્ય રીતે જાળવવા માટે SPECC1L કાર્ય કરે છે. સંસ્થાના સ્નાયુઓ.એક્ટિન સાયટોસ્કેલેટન.એક્ટિન સાયટોસ્કેલેટન અને β-કેટેનિન સાથે SPECC1L નું જોડાણ અને SPECC1L ની ગેરહાજરીમાં કન્ડેન્સ્ડ એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સની સંખ્યામાં વધારો એજે ઘનતામાં જોવા મળેલા વધારા સાથે સુસંગત છે.બીજી શક્યતા એ છે કે SPECC1L-ની ઉણપવાળા કોષોમાં એક્ટીન ફાઇબરની સંખ્યામાં વધારો આંતરસેલ્યુલર તણાવમાં ફેરફાર તરફ દોરી જાય છે.કારણ કે સેલ્યુલર તણાવ AJ 33 ગતિશીલતાને અસર કરે છે, વોલ્ટેજ ફેરફારો વધુ પ્રસરેલા AJ 34 માં પરિણમી શકે છે.તેથી કોઈપણ ફેરફારો CNCC સ્તરોને અસર કરશે.
Wnt1 પ્રારંભિક ન્યુરલ ફોલ્ડ્સમાં વ્યક્ત થાય છે જે ન્યુરલ ક્રેસ્ટ કોષોને જન્મ આપે છે.આમ, Wnt1-cre વંશ ટ્રેસીંગ NCC35 પહેલા અને સ્થળાંતર બંનેને ચિહ્નિત કરે છે.જો કે, Wnt1 પ્રારંભિક ન્યુરલ ફોલ્ડ્સ 35,36 માંથી મેળવેલા ડોર્સલ બ્રેઈન ટિશ્યુ ક્લોન્સને પણ ચિહ્નિત કરે છે, જેનાથી ઓપન ન્યુરલ ફોલ્ડ્સમાં Wnt1 માર્કર્સ માટે E9.5 મ્યુટન્ટ્સનું સ્ટેનિંગ CNCC નથી તેવી શક્યતા બનાવે છે.NCC માર્કર્સ AP2A અને SOX10 માટેના અમારા સકારાત્મક સ્ટેનિંગે પુષ્ટિ કરી છે કે Specc11 મ્યુટન્ટ એમ્બ્રોયોના ખુલ્લા ન્યુરલ ફોલ્ડ્સમાં ખરેખર CNCC છે.વધુમાં, AP2A અને SOX10 પ્રારંભિક સ્થાનાંતરિત NCCના માર્કર હોવાથી, હકારાત્મક સ્ટેનિંગ સૂચવે છે કે આ કોષો પોસ્ટ-માઇગ્રેટરી CNCC છે જે E9.5 દ્વારા સ્તરીકરણ કરી શકાતા નથી.
અમારો ડેટા સૂચવે છે કે SPECC1L દ્વારા AJ નું મોલેક્યુલર નિયમન PI3K-AKT સિગ્નલિંગ દ્વારા મધ્યસ્થી કરવામાં આવે છે.AKT સિગ્નલિંગ SPECC1L ની ઉણપવાળા કોષો અને પેશીઓમાં ઘટાડો થાય છે.Fantauzzo et al દ્વારા તારણો.ક્રેનિયોફેસિયલ મોર્ફોજેનેસિસમાં PI3K-AKT સિગ્નલિંગ માટે સીધી ભૂમિકાને સમર્થન આપે છે.(2014) દર્શાવે છે કે PDGFRα-આધારિત PI3K-AKT સિગ્નલિંગના સક્રિયકરણનો અભાવ ક્લેફ્ટ પેલેટ ફેનોટાઇપ તરફ દોરી જાય છે.અમે એ પણ બતાવીએ છીએ કે PI3K-AKT પાથવેનું અવરોધ U2OS કોષોમાં AJ અને સેલ આકાર બદલવા માટે પૂરતું છે.અમારા તારણો સાથે સુસંગત, કેઈન એટ અલ.37 દર્શાવે છે કે એન્ડોથેલિયલ કોષોમાં PI3K α110 સબ્યુનિટના ડાઉનરેગ્યુલેશનના પરિણામે પેરીસેલ્યુલર β-કેટેનિન સ્ટેનિંગમાં સમાન વધારો થાય છે, જેને "કનેક્ટિવિટી ઇન્ડેક્સ" માં વધારો તરીકે ઓળખવામાં આવે છે.જો કે, એન્ડોથેલિયલ કોશિકાઓમાં જેમના એક્ટિન ફિલામેન્ટ્સ પહેલેથી જ ખૂબ જ વ્યવસ્થિત છે, PI3K-AKT પાથવેનું દમન ઢીલા સેલ આકારમાં પરિણમે છે.તેનાથી વિપરીત, SPECC1L-kd U2OS કોષોએ વિસ્તૃત કોષનો આકાર દર્શાવ્યો હતો.આ તફાવત સેલ પ્રકાર ચોક્કસ હોઈ શકે છે.જ્યારે PI3K-AKT સિગ્નલિંગનું દમન એ એક્ટિન સાયટોસ્કેલેટનને કાયમી ધોરણે અસર કરે છે, ત્યારે સેન્ટ્રલ એક્ટિન ફાઇબરની ઘનતા અને સંગઠનમાં ફેરફારને કારણે થતા તણાવમાં ફેરફાર દ્વારા કોષના આકાર પરની અસર નક્કી કરવામાં આવે છે.U2OS કોષોમાં, અમે SPECC1L-ઉણપ AJ ફેરફાર અને પુનઃપ્રાપ્તિના માર્કર તરીકે માત્ર સેલ આકારના ફેરફારોનો ઉપયોગ કર્યો છે.નિષ્કર્ષમાં, અમે અનુમાન કરીએ છીએ કે SPECC1L ની ઉણપમાં AKT પાથવેના અવરોધથી AJ સ્થિરતા વધે છે અને CNCC માં ડિલેમિનેશન ઘટાડે છે.
રસપ્રદ વાત એ છે કે, SPECC1L ની ગેરહાજરીમાં ફોસ્ફોરીલેટેડ 473-AKT સ્તરો ઉપરાંત વિટ્રો અને વિવોમાં પાન-AKT સ્તરોમાં ઘટાડો થયો હતો, જે AKT પ્રોટીન સ્થિરતા અથવા ટર્નઓવરના સ્તરે PI3K-AKT સિગ્નલિંગના નિયમનનું સૂચન કરે છે.SPECC1L અને MID1 જનીનો, બંને Opitz/GBBB સિન્ડ્રોમ સાથે સંકળાયેલા છે, પ્રોટીનને એન્કોડ કરે છે જે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ 18,22 ને સ્થિર કરે છે.જે પદ્ધતિ દ્વારા SPECC1L અને MID1 માઇક્રોટ્યુબ્યુલ સ્ટેબિલાઇઝેશનની મધ્યસ્થી કરે છે તે સંપૂર્ણપણે સમજી શકાયું નથી.SPECC1L ના કિસ્સામાં, આ સ્થિરીકરણમાં માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ 18 ના સબસેટના ઉન્નત એસિટિલેશનનો સમાવેશ થાય છે.શક્ય છે કે SPECC1L અન્ય પ્રોટીન જેમ કે AKT ને સ્થિર કરવા માટે સમાન પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરે છે.એવું દર્શાવવામાં આવ્યું છે કે AKT પ્રોટીનમાં લાયસિન અવશેષોનું એસિટિલેશન મેમ્બ્રેન સ્થાનિકીકરણ અને ફોસ્ફોરાયલેશન 38 માં ઘટાડો તરફ દોરી જાય છે.વધુમાં, AKT પર સમાન લાયસિન અવશેષો પર K63 સાંકળનું સર્વવ્યાપકીકરણ તેના મેમ્બ્રેન સ્થાનિકીકરણ અને સક્રિયકરણ 39,40 માટે જરૂરી છે.વિવિધ ઉચ્ચ થ્રુપુટ યીસ્ટ બે-હાઇબ્રિડ સ્ક્રીનમાં ઓળખાતા SPECC1L પ્રોટીન સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરતા ઘણા પરિબળોમાં, ચાર - CCDC841, ECM2942, APC અને UBE2I43 - પ્રોટીન ટર્નઓવર અથવા સર્વવ્યાપકતા અથવા સુમોયલેશન દ્વારા સ્થિરતામાં સંકળાયેલા છે.SPECC1L એ AKT લાયસિન અવશેષોના અનુવાદ પછીના ફેરફારમાં સામેલ હોઈ શકે છે, જે AKT સ્થિરતાને અસર કરે છે.જો કે, AKT પ્રોટીનના સ્થાનિકીકરણ અને સ્થિરતામાં SPECC1L ની નિર્ણાયક ભૂમિકા સ્પષ્ટ કરવાની બાકી છે.
વિવોમાં SPECC1L અભિવ્યક્તિમાં ગંભીર ખામીના પરિણામે AJ માર્કર સ્ટેનિંગ અને ખામીયુક્ત CNCC ઓવરલે, તેમજ એપોપ્ટોસિસ અને પ્રારંભિક ગર્ભ ઘાતકતામાં વધારો થયો.અગાઉના અહેવાલો દર્શાવે છે કે એપોપ્ટોસીસના વધેલા સ્તર સાથે માઉસ મ્યુટન્ટ્સ ન્યુરલ ટ્યુબ ખામી 44,45,46,47 અને ક્રેનિયોફેસિયલ ખામી 48 સાથે સંકળાયેલા છે.એવું સૂચવવામાં આવ્યું છે કે ન્યુરલ ફોલ્ડ્સ અથવા ફેરીન્જિયલ કમાનોમાં વધુ પડતા કોષ મૃત્યુને પરિણામે યોગ્ય મોર્ફોજેનેટિક ચળવળ 48,49,50 માટે જરૂરી કોષોની અપૂરતી સંખ્યા થઈ શકે છે.તેનાથી વિપરીત, સાધારણ ઘટાડો SPECC1L અભિવ્યક્તિ સાથેની અમારી SPECC1L ઉણપવાળી કોષ રેખાઓ વધેલા કોષ મૃત્યુના પુરાવા વિના માત્ર AJ ફેરફારો દર્શાવે છે.જો કે, આ Kd કોષોમાં PI3K-AKT પાથવેના રાસાયણિક અવરોધના પરિણામે એપોપ્ટોસિસમાં વધારો થયો હતો.આમ, SPECC1L અભિવ્યક્તિ અથવા કાર્યમાં મધ્યમ ઘટાડો કોષના અસ્તિત્વને સુનિશ્ચિત કરે છે.આ અવલોકન સાથે સુસંગત છે કે દુર્લભ Specc11 મ્યુટન્ટ એમ્બ્રોયો જે સેન્ટમાં ધરપકડથી બચી જાય છે.E9.5—કદાચ જનીન કેપ્ચર કાર્યક્ષમતામાં ઘટાડો થવાને કારણે-તેમની ન્યુરલ ટ્યુબને બંધ કરવામાં અને વિકાસમાં પાછળથી રોકવામાં સક્ષમ છે, ઘણીવાર ક્રેનિયોફેસિયલ ખામીઓ (ફિગ. S3).ક્રેનિયોફેસિયલ અસાધારણતા સાથે હેટરોઝાયગસ સ્પેક1એલ એમ્બ્રોયોની દુર્લભ ઘટના પણ આની સાથે સુસંગત છે-કદાચ જનીન કેપ્ચર કાર્યક્ષમતામાં વધારો થવાને કારણે-તેમજ ઝેબ્રાફિશમાં શોધ જેમાં બે SPECC1L ઓર્થોલોગ્સ (સ્પેક1lb) માંથી એક એમ્બ્રોયસ લેટિન લેટિનનું કારણ બને છે. નીચલા જડબાં અને દ્વિપક્ષીય ફાટ51.આમ, માનવ દર્દીઓમાં ઓળખાતા હેટરોઝાઇગસ SPECC1L કાર્યમાં ખોટ-પરિવર્તન ક્રેનિયોફેસિયલ મોર્ફોજેનેસિસ દરમિયાન SPECC1L કાર્યમાં નાની ક્ષતિઓનું કારણ બની શકે છે, જે તેમના ઓરોફેસિયલ ક્લેફ્ટ્સને સમજાવવા માટે પૂરતા છે.ઇન્ટરસેલ્યુલર સંપર્કોનું SPECC1L-આધારિત નિયમન પણ પેલેટોજેનેસિસ અને ફેરીન્જિયલ કમાનોના સંમિશ્રણમાં ભૂમિકા ભજવી શકે છે.SPECC1L કાર્યના વધુ અભ્યાસો ન્યુરોએપિથેલિયલ સેલ ગતિશીલતા અને ક્રેનિયોફેસિયલ મોર્ફોજેનેસિસમાં ન્યુરલ ટ્યુબ બંધ થવા દરમિયાન CNCC માં અસ્થાયી આંતરસેલ્યુલર સંપર્કોની ભૂમિકાને સ્પષ્ટ કરવામાં મદદ કરશે.
U2OS ઑસ્ટિઓસારકોમા નિયંત્રણ અને SPECC1L-kd કોષોનું અગાઉ વર્ણન કરવામાં આવ્યું છે (સાદી એટ અલ., 2011).SPECC1L સામે એન્ટિબોડીઝ પણ અગાઉ દર્શાવવામાં આવી છે (સાદી એટ અલ., 2011).એન્ટિ-બીટા-કેટેનિન એન્ટિબોડીઝ (સસલું; 1:1000; સાન્ટા ક્રુઝ, ડલ્લાસ, TX) (માઉસ; 1:1000; સેલ સિગ્નલિંગ ટેક્નોલોજી, ડેનવર્સ, MA), માયોસિન IIb (1:1000; સિગ્મા-એલ્ડ્રીચ, સેન્ટ. લુઇસ ). , કેલિફોર્નિયા), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; સેલ સિગ્નલિંગ ટેકનોલોજી, ડેનવર્સ, MA), pan-AKT (1:1000; થર્મોફિશર સાયન્ટિફિક, વોલ્થમ, MA ) , KI67 (1:1000; સેલ સિગ્નલિંગ ટેક્નોલોજી, ડેનવર્સ, MA), ક્લીવ્ડ કેસ્પેસ 3 (1:1000; સેલ સિગ્નલિંગ ટેક્નોલોજી, ડેનવર્સ, MA) અને β-એક્ટિન (1:2500; સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ, સેન્ટ. લુઇસ, MO) નો ઉપયોગ વર્ણવ્યા પ્રમાણે કરવામાં આવ્યો હતો..એક્ટીન ફિલામેન્ટ એક્ટી-સ્ટેઈન રોડામાઈન ફેલોઈડિન (સાયટોસ્કેલેટન, ડેનવર, કોલોરાડો) થી ડાઘવાળા હતા.
U2OS નિયંત્રણ કોષો અને SPECC1L-kd કોષોને 10% ગર્ભ બોવાઇન સીરમ (લાઇફ ટેક્નોલોજી, કાર્લ્સબેડ, CA) સાથે પૂરક પ્રમાણભૂત ઉચ્ચ ગ્લુકોઝ DMEM માં સંવર્ધન કરવામાં આવ્યા હતા.AJ ફેરફારો માટે, 0.1% પોર્સિન જિલેટીન (સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ, સેન્ટ લુઇસ, MO) સાથે સારવાર કરાયેલા કાચ પર 2 x 105 કોષો સીડ કરવામાં આવ્યા હતા અને કોષના આકારમાં ફેરફાર માટે અવલોકન કરવામાં આવ્યા હતા.કોષો અલગ-અલગ દર્શાવેલ સમય બિંદુઓ પર એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા: બીજ વાવવાના 4 કલાક પછી (t = 1), બીજ વાવવાના 24 કલાક પછી (t = 2), કોષના આકારમાં ફેરફાર વિના સંગમ (t = 3), કોષના આકારમાં ફેરફાર (t = 4) , કોષના આકારમાં ફેરફાર પછી 24 કલાક (t = 5) અને 48 કલાક પછી કોષના આકારમાં ફેરફાર (t = 6) (ફિગ. 1, 2, 3).PI3K-AKT પાથવેને મોડ્યુલેટ કરવા માટે, કોષોને PI3K-AKT અવરોધક વોર્ટમેનિન (TOCRIS બાયોસાયન્સિસ, મિનેપોલિસ, મિનેસોટા) અથવા SC-79 એક્ટિવેટર (TOCRIS બાયોસાયન્સિસ, મિનેપોલિસ એડમ્સ) સાથે સૂચવેલ સાંદ્રતા પર સંવર્ધિત કરવામાં આવ્યા હતા.રસાયણો ધરાવતું માધ્યમ દરરોજ બદલાતું હતું.
ફ્રેમ-બાય-ફ્રેમ રેકોર્ડિંગ લાઇવ કંટ્રોલ અને કેડી સેલ પર સામાન્ય સંસ્કૃતિની સ્થિતિમાં કરવામાં આવ્યા હતા, અને 7 દિવસ માટે દર 10 મિનિટે ફેઝ કોન્ટ્રાસ્ટ ઇમેજ એકત્રિત કરવામાં આવી હતી.મિકેનિકલ સ્ટેજ અને QImaging Retiga-SRV કેમેરા સાથે જોડાયેલ 10 × N-PLAN ઉદ્દેશ્યથી સજ્જ કમ્પ્યુટર-નિયંત્રિત Leica DM IRB ઇન્વર્ટેડ માઈક્રોસ્કોપનો ઉપયોગ કરીને છબીઓ હસ્તગત કરવામાં આવી હતી.ઇમેજિંગ દરમિયાન, 5% CO2 સાથે ભેજવાળા વાતાવરણમાં 37°C પર સેલ કલ્ચર જાળવવામાં આવ્યું હતું.
પ્રાદેશિક મ્યુટન્ટ માઉસ રિસોર્સ સેન્ટર (UC ડેવિસ, CA) માંથી બે જનીન ટ્રેપ ES સેલ લાઇન્સ DTM096 અને RRH048 નો ઉપયોગ Specc11 ઉણપવાળી માઉસ લાઇન, નિયુક્ત Specc1lgtDTM096 અને Specc1lgtRRH046 બનાવવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.સંક્ષિપ્તમાં, 129/REJ ES કોષોને C57BL6 બ્લાસ્ટોસિસ્ટ્સમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા.પરિણામી કાઇમરિક નર ઉંદરને માદા C57BL6 ઉંદર સાથે ઉછેરવામાં આવ્યા હતા જેથી અગૌટી કોટ રંગ સાથે સંતાનને ઓળખવામાં આવે.જનીન ટ્રેપ વેક્ટર ઇન્સર્ટ્સની હાજરીનો ઉપયોગ હેટરોઝાયગોટ્સને ઓળખવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.ઉંદરને 129/REJ;C57BL6 ની મિશ્ર પૃષ્ઠભૂમિ પર રાખવામાં આવ્યા હતા.RT-PCR, જિનોમ સિક્વન્સિંગ અને આનુવંશિક પૂરક (પૂરક આકૃતિ 1) દ્વારા આનુવંશિક ટ્રેપ વેક્ટરના નિવેશ સ્થળના સ્થાનની પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી.ડબલ હેટરોઝાયગસ સ્પેક1એલજીટી ઉંદરના સીએનસીસી વંશને ટ્રેસ કરવા માટે, ROSAmTmG (#007576) અને Wnt1-Cre (#003829) ઉંદર (જેક્સન લેબોરેટરી, બાર હાર્બર, ME) ને તમામ એમ્બ્યુલેન્ટ મ્યુઝિકમાં ROSAmTmG અને Wnt1-Creeles પેદા કરવા માટે ક્રોસ કરવામાં આવ્યા હતા.યુનિવર્સિટી ઓફ કેન્સાસ મેડિકલ સેન્ટરની સંસ્થાકીય એનિમલ કેર એન્ડ યુઝ કમિટી દ્વારા મંજૂર કરાયેલ પ્રોટોકોલ અનુસાર ઉંદરમાં તમામ પ્રયોગો કરવામાં આવ્યા હતા.
ભ્રૂણને ઓરડાના તાપમાને 60 મિનિટ માટે (1% ફોર્માલ્ડીહાઈડ, 0.2% ગ્લુટારાલ્ડીહાઈડ, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) માં નિશ્ચિત કરવામાં આવ્યા હતા.એક્સ-ગેલ સ્ટેનિંગ સોલ્યુશનમાં ફિક્સેશન પછી (5 એમએમ પોટેશિયમ ફેરીસાયનાઇડ, 5 એમએમ પોટેશિયમ ફેરોસાયનાઇડ, 2 એમએમ એમજીસીએલ2, 0.01% સોડિયમ ડીઓક્સીકોલેટ, 0.02% એનપી-40, 1 એમજી/એમએલ એક્સ-ગેલ) સ્ટેન ડેવલપમેન્ટ 3 ° સે પર કરવામાં આવ્યું હતું. .1-6 કલાકની અંદર °C.ભ્રૂણને 4% PFA માં પોસ્ટ-ફિક્સ કરવામાં આવ્યા હતા અને વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવામાં આવ્યા હતા.
વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ માટે, કોષોને નિષ્ક્રિય લિસિસ બફર (પ્રોમેગા, ફિચબર્ગ, WI) માં HALT પ્રોટીઝ અવરોધકો (સિગ્મા-આલ્ડ્રિચ, સેન્ટ લૂઇસ, એમઓ) ના મિશ્રણ સાથે પૂરક બનાવવામાં આવ્યા હતા.લિસેટ્સને 12% પોલિએક્રિલામાઇડ મિની-પ્રોટીન ટીજીએક્સ તૈયાર જેલ (બાયો-રેડ, હર્ક્યુલસ, સીએ) પર પ્રક્રિયા કરવામાં આવી હતી અને ઇમોબિલોન પીવીડીએફ મેમ્બ્રેન (EMD મિલિપોર, બિલેરિકા, MA) માં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવી હતી.પીબીએસમાં 0.1% ટ્વીન ધરાવતા 5% દૂધમાં પટલને અવરોધિત કરવામાં આવી હતી.એન્ટિબોડીઝને રાતોરાત 4 ડિગ્રી સેલ્સિયસ અથવા ઓરડાના તાપમાને એક કલાક માટે ઉકાળવામાં આવી હતી.ફેમટો સુપરસિગ્નલ વેસ્ટ ECL રીએજન્ટ (થર્મો સાયન્ટિફિક, વોલ્થમ, MA) નો ઉપયોગ સિગ્નલ જનરેશન માટે કરવામાં આવ્યો હતો.ઇમ્યુનોસ્ટેનિંગ માટે, એમ્બ્રોયોને 4% PFA/PBS માં રાતોરાત નિશ્ચિત કરવામાં આવ્યા હતા અને ક્રિઓપ્રીઝર્વ્ડ કરવામાં આવ્યા હતા.પીબીએસમાં 1% સામાન્ય બકરી સીરમ (થર્મો સાયન્ટિફિક, વોલ્થમ, MA) અને 0.1% ટ્રાઇટોન X-100 (સિગ્મા-આલ્ડ્રિચ, સેન્ટ લૂઈસ, એમઓ) ધરાવતા ટીશ્યુ ક્રાયોસેક્શનને અવરોધિત કરવામાં આવ્યા હતા અને પછી ઇન્ક્યુબેટરમાં 4°C પર ઉકાળવામાં આવ્યા હતા. રાતએન્ટિ-એન્ટિબોડી અને ફ્લોરોસન્ટ સેકન્ડરી એન્ટિબોડી (1:1000) સાથે 4°C પર 1 કલાક માટે.સ્ટેઇન્ડ વિભાગો પ્રોલોંગ ગોલ્ડ મિડિયમ (થર્મો સાયન્ટિફિક, વોલ્થમ MA) માં મૂકવામાં આવ્યા હતા અને લેઇકા TCS SPE કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપનો ઉપયોગ કરીને ફ્લેટ છબીઓ મેળવવામાં આવી હતી.દરેક ઇમ્યુનોસ્ટેનિંગ ઓછામાં ઓછા બે મ્યુટન્ટ એમ્બ્રોયોના સિરોસેક્શન પર ત્રણ સ્વતંત્ર પ્રયોગો તરીકે કરવામાં આવ્યું હતું.એક પ્રતિનિધિ પ્રયોગ બતાવવામાં આવ્યો છે.
કોષો સંશોધિત RIPA બફર (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% ગ્લિસરોલ, 2 mM EDTA, અને HALT પ્રોટીઝ અવરોધક (સિગ્મા-આલ્ડ્રિચ, સેન્ટ લૂઇ)) માં ઉકાળવામાં આવ્યા હતા. સંક્ષિપ્તમાં, લાઇસેટ્સને પ્રોટીન જી મેગ્નેટિક મણકા (લાઇફ ટેક્નોલૉજી, કાર્લ્સબેડ, CA) વડે પ્રીપ્યુરિફાઇડ કરવામાં આવ્યું હતું અને પછી 4° સે પર રાતોરાત પકવવામાં આવ્યું હતું. એન્ટી-સ્પેકસી1એલ અથવા આઇજીજી પ્રોટીન જી પ્રોટીન મણકાનો ઉપયોગ SPECC1L કાઢવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો અને વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ એન્ટી-એસપીસીસી1એલનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યો હતો. ઉપર વર્ણવેલ -β-કેટેનિન એન્ટિબોડી દર્શાવેલ સહ-IP પ્રયોગો ચાર સ્વતંત્ર પ્રયોગોના પ્રતિનિધિ છે.
યુનિવર્સિટી ઓફ કેન્સાસ મેડિકલ સેન્ટર ખાતે ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી સેન્ટરને સ્થિર સંવર્ધિત કોષો અથવા માઉસ ગર્ભ પેશીઓ પ્રદાન કરવામાં આવ્યા હતા.સંક્ષિપ્તમાં, નમૂનાઓ EMbed 812 રેઝિન (ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી સાયન્સ, ફોર્ટ વોશિંગ્ટન, PA) માં એમ્બેડ કરવામાં આવ્યા હતા, 60°C પર રાતોરાત પોલિમરાઇઝ્ડ, અને ડાયમંડ બ્લેડથી સજ્જ Leica UC7 અલ્ટ્રામાઇક્રોટોમનો ઉપયોગ કરીને 80 nm પર વિભાગ કરવામાં આવ્યા હતા.100 kV લેબ6 બંદૂકથી સજ્જ JEOL JEM-1400 ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપનો ઉપયોગ કરીને વિભાગોની કલ્પના કરવામાં આવી હતી.
આ લેખ કેવી રીતે ટાંકવો: વિલ્સન, એનઆર એટ અલ.SPECC1L ની ઉણપ વિભાજિત સાંધાઓની સ્થિરતામાં વધારો અને ક્રેનિયલ ન્યુરલ ક્રેસ્ટ કોશિકાઓના ઘટાડાને કારણે થાય છે.વિજ્ઞાન6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
સેન્ટ-જીએન, જે.-પી.ન્યુરલ ક્રેસ્ટનું ઇન્ડક્શન અને ભિન્નતા.(સ્પ્રિંગર સાયન્સ + બિઝનેસ મીડિયા; લેન્ડેસ બાયોસાયન્સ/Eurekah.com, 2006).
કોર્ડેરો, ડીઆર એટ અલ.ક્રેનિયલ ન્યુરલ ક્રેસ્ટ કોષો ગતિમાં છે: ક્રેનિયોફેસિયલ વિકાસમાં તેમની ભૂમિકા.અમેરિકન જર્નલ ઓફ મેડિકલ જીનેટિકસ.ભાગ A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
બોલેન્ડ, આરપી ન્યુરોક્રિસ્ટોપેથિયા: 20 વર્ષોમાં તેની વૃદ્ધિ અને વિકાસ.બાળરોગ ચિકિત્સક.પેથોલોજી.પ્રયોગશાળાદવા.17, 1–25 (1997).
મેન્ગોલ્ડ ઇ., લુડવિગ કેયુ અને નોટેન એમએમ બ્રેકથ્રુ ઓરોફેસિયલ ક્લેફ્ટ્સના જિનેટિક્સમાં.મોલેક્યુલર મેડિસિન 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
મિનુ, એમ. અને રિલે, એફએમ ક્રેનિયોફેસિયલ વિકાસ દરમિયાન ક્રેનિયલ ન્યુરલ ક્રેસ્ટ સેલ સ્થળાંતર અને પેટર્નિંગની મોલેક્યુલર મિકેનિઝમ્સ.વિકાસ 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
ડિક્સન, એમજે, મરાઝિટા, એમએલ, બીટી, ટીએચ અને મુરે, જેકે ક્લેફ્ટ લિપ એન્ડ પેલેટ: આનુવંશિક અને પર્યાવરણીય પ્રભાવોને સમજવું.કુદરતી ટિપ્પણી.જિનેટિક્સ 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
ઇન્ગ્રામ, સીઆર એટ અલ.ઇન્ટરફેરોન-રેગ્યુલેટીંગ ફેક્ટર-6 (Irf6)-ની ઉણપમાં ત્વચા, અંગો અને ક્રેનિયોફેસિયલ પ્રદેશનું અસામાન્ય મોર્ફોજેનેસિસ.નેશનલ જેનેટ.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.GRHL3 માં પ્રબળ પરિવર્તનો વેન ડેર વોર્ડ સિન્ડ્રોમનું કારણ બને છે અને મૌખિક પેરીડર્મના વિકાસને અવરોધે છે.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
હેરિસ, એમજે અને જુરીલોફ, ડીએમ ન્યુરલ ટ્યુબ બંધ થવામાં ખામીઓ સાથે માઉસ મ્યુટન્ટ્સની સૂચિ અપડેટ કરો અને ન્યુરલ ટ્યુબ બંધ થવાની સંપૂર્ણ આનુવંશિક સમજ તરફ પ્રગતિ કરો.જન્મજાત ખામીઓની તપાસ.ભાગ A, ક્લિનિકલ અને મોલેક્યુલર ટેરેટોલોજી 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA અને Soriano, P. PI3K- મધ્યસ્થી PDGFRalpha સિગ્નલિંગ p53-આશ્રિત અંતઃકોશિક માર્ગ દ્વારા હાડપિંજરના વિકાસમાં અસ્તિત્વ અને પ્રસારને નિયંત્રિત કરે છે.જીન ડેવલપમેન્ટ 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
કોપ્પ, એજે, ગ્રીન, એનડી અને મર્ડોક, જેએન ડિશેવેલ્ડ: રિલેશન ઓફ કન્વર્જન્ટ એક્સ્પાન્સન ટુ ન્યુરલ ટ્યુબ ક્લોઝર.ન્યુરોલોજીમાં વલણો.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).