347 સ્ટેનલેસ સ્ટીલ કોઇલ્ડ ટ્યુબિંગ રાસાયણિક ઘટક, ક્રોસ-લિંક્ડ માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (CLMS) નો ઉપયોગ કરીને નવલકથા ઇન્ટરફેરોન-રિસ્પોન્સિવ માનવ લ્યુકોસાઇટ એન્ટિજેન-A (HLA-A) ચેપરોન પ્રોટીનની ઓળખ

Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર.તમે મર્યાદિત CSS સપોર્ટ સાથે બ્રાઉઝર સંસ્કરણનો ઉપયોગ કરી રહ્યાં છો.શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે અપડેટ કરેલ બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરો (અથવા Internet Explorer માં સુસંગતતા મોડને અક્ષમ કરો).વધુમાં, ચાલુ સમર્થનની ખાતરી કરવા માટે, અમે શૈલીઓ અને JavaScript વિના સાઇટ બતાવીએ છીએ.
સ્લાઇડર્સ સ્લાઇડ દીઠ ત્રણ લેખો દર્શાવે છે.સ્લાઇડ્સમાંથી આગળ વધવા માટે પાછળના અને આગળના બટનોનો ઉપયોગ કરો અથવા દરેક સ્લાઇડમાંથી આગળ વધવા માટે અંતે સ્લાઇડ કંટ્રોલર બટનોનો ઉપયોગ કરો.

ઉત્પાદન વર્ણન

સ્ટેનલેસ સ્ટીલ 347L કોઇલ ટ્યુબ્સ, સ્ટીલ ગ્રેડ: SS347L

ઇન્ટરફેરોન સિગ્નલિંગ સિસ્ટમ પર્યાવરણમાંથી પેથોજેનિક અને આંતરિક રોગવિજ્ઞાનવિષયક સિગ્નલોની વિશાળ શ્રેણી માટે મજબૂત સાયટોકાઇન પ્રતિભાવ પ્રેરિત કરે છે, જેના પરિણામે ઇન્ટરફેરોન-ઇન્ડ્યુસિબલ પ્રોટીનના સબસેટ્સનો સમાવેશ થાય છે.ઇન્ટરફેરોન-પ્રેરિત પ્રોટીનના ડોમેનમાં નવી પ્રોટીન-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ શોધવા માટે અમે DSS-મધ્યસ્થી ક્રોસ-લિંક માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (CLMS) લાગુ કરી.અપેક્ષિત ઇન્ટરફેરોન-ઇન્ડ્યુસિબલ પ્રોટીન ઉપરાંત, અમે MX1, USP18, OAS3 અને STAT1 જેવા કેનોનિકલ ઇન્ટરફેરોન-ઇન્ડ્યુસિબલ પ્રોટીનના નવલકથા ઇન્ટરમોલેક્યુલર અને ઇન્ટ્રામોલેક્યુલર ક્રોસ-લિંક્ડ એડક્ટ્સને પણ ઓળખ્યા.અમે HLA-A પ્રોટીન (H2BFS-HLA-A-HMGA1) દ્વારા કો-ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશનનો ઉપયોગ કરીને રચાયેલા ઇન્ટરફેરોન-ઇન્ડ્યુસિબલ પ્રોટીન નેટવર્કના નવલકથા સમૂહની ઓર્થોગોનલ માન્યતા અને મોલેક્યુલર ડાયનેમિક્સ મોડેલિંગનો ઉપયોગ કરીને તેમના આગળના અભ્યાસ પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કર્યું.પ્રોટીન કોમ્પ્લેક્સની રચનાત્મક ગતિશીલતાના મોડેલિંગે ઘણી ક્રિયાપ્રતિક્રિયા સાઇટ્સ જાહેર કરી જે CLMS તારણોમાં ઓળખાયેલી ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને પ્રતિબિંબિત કરે છે.સાથે મળીને, અમે ઇન્ટરફેરોન દ્વારા પ્રેરિત નવા સિગ્નલિંગ કોમ્પ્લેક્સને ઓળખવા માટે CLMS નો પાયલોટ અભ્યાસ રજૂ કરીએ છીએ, અને ટ્યુમર માઇક્રોએનવાયરમેન્ટમાં પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓની નવી ગતિશીલતાને ઓળખવા માટે CLMS ના વ્યાપક ઉપયોગની રાહ જોઈ રહ્યા છીએ.
અનુકૂલનશીલ રોગપ્રતિકારક પ્રતિભાવ શરૂ થાય તે પહેલાં, યજમાનની જન્મજાત સંરક્ષણ પ્રણાલી ઇન્ટરફેરોન્સ (IFNs) તરીકે ઓળખાતા સ્ત્રાવિત આલ્ફા-હેલિકલ સાયટોકાઇન્સના પરિવાર દ્વારા મધ્યસ્થી કરવામાં આવતા એન્ટિમાઇક્રોબાયલ પ્રતિભાવને માઉન્ટ કરે છે.પ્રકાર I IFN વર્ગો IFNα અને IFNβ સેલ્યુલર પ્રતિભાવોને સક્રિય કરે છે, જેમાં એન્ટિવાયરલ, પ્રોઆપોપ્ટોટિક, પ્રોઇનફ્લેમેટરી અને એન્ટિપ્રોલિફેરેટિવ સ્ટેટ્સનો સમાવેશ થાય છે.મનુષ્યોમાં, IFNα ના 13 પેટા પ્રકારો જાણીતા છે, જે બધા રંગસૂત્ર 91 પર ક્લસ્ટર થયેલ છે. આશ્ચર્યજનક રીતે, ક્લિનિકલ ઉપયોગ માટે માત્ર IFNα2 નો અભ્યાસ કરવામાં આવ્યો છે.તાજેતરમાં, IFNα ના અન્ય પેટા પ્રકારો પર સંશોધન પર વિશેષ ધ્યાન આપવામાં આવ્યું છે.તાજેતરના અભ્યાસે દર્શાવ્યું છે કે પ્રમાણભૂત IFNα2 પેટાપ્રકારની તુલનામાં IFNα14 એ HBV2 અને HIV-13,4 પ્રતિકૃતિને પ્રતિબંધિત કરવામાં સૌથી અસરકારક આઇસોફોર્મ્સમાંનું એક છે.
તે સ્થાપિત કરવામાં આવ્યું છે કે સક્રિય પ્રકાર I ઇન્ટરફેરોન રીસેપ્ટર કોમ્પ્લેક્સ (IFNAR1 અને IFNAR2) જેનુસ કિનાસેસ TYK2 અને JAK15,6 દ્વારા મધ્યસ્થી સિગ્નલ ટ્રાન્સડક્શન કાસ્કેડને ટ્રિગર કરે છે.આ જાનુસ કિનાસેસ ફોસ્ફોરીલેટ સિગ્નલ ટ્રાન્સડ્યુસર્સ અને ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ પ્રોટીન એક્ટિવેટર્સ (STAT1 અને STAT2) ને ટાયરોસિન અવશેષો પર SH2 ડોમેન-મધ્યસ્થી હેટરોડીમરાઇઝેશન 6 શરૂ કરવા માટે.ત્યારબાદ, IRF9 એ IFN-સ્ટિમ્યુલેટેડ ફેક્ટર 3 જનીન (ISGF3) નું ટ્રાઈમેરિક કોમ્પ્લેક્સ રચવા માટે STAT હેટરોડીમર્સને જોડે છે, જે ન્યુક્લિયસમાં સ્થાનાંતરિત થાય છે અને 2000 થી વધુ ઇન્ટરફેરોન-સ્ટિમ્યુલેટેડ જનીનો (ISGs)5,6,7, નું ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રેરિત કરે છે.
ISGs જન્મજાત રોગપ્રતિકારક શક્તિની કરોડરજ્જુ બનાવે છે, ખાસ કરીને વાયરલ હુમલાના પ્રતિભાવમાં.વાયરલ ચેપ સામે સંરક્ષણની પ્રથમ લાઇન તરીકે, કોષો જૈવિક પ્રવૃત્તિઓની વિશાળ શ્રેણી સાથે સેલ્યુલર પ્રોટીનની વ્યાપક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને ઝડપથી જમાવે છે.આ પ્રોટીનમાં પેટર્ન રેકગ્નિશન રીસેપ્ટર્સ, સિગ્નલિંગ મોલેક્યુલ્સ, ટ્રાન્સક્રિપ્શન ફેક્ટર્સ અને ડાયરેક્ટ એન્ટિવાયરલ ફંક્શન્સ સાથેના પ્રોટીન, તેમજ રોગપ્રતિકારક પ્રતિક્રિયાના નકારાત્મક નિયમનકારોનો સમાવેશ થાય છે.ISG પ્રવૃત્તિ પરની મોટાભાગની માહિતી ઓવરએક્સપ્રેશન સ્ક્રીન્સ 10,11 અથવા જનીન મૌન કરવાની તકનીકો (siRNA, RNAi અને CRISPR)12,13નો ઉપયોગ કરીને કાર્યાત્મક સ્ક્રીનોમાંથી આવે છે જેમાં વ્યક્તિગત ISG વ્યક્ત કરવામાં આવે છે અથવા અટકાવવામાં આવે છે અને તેમની પ્રવૃત્તિનું વિવિધ વાયરસ પર પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે.આ અભ્યાસોએ વ્યક્તિગત ISG ના એન્ટિવાયરલ ગુણધર્મો નક્કી કર્યા હોવા છતાં, દરેક ISG ની અંતર્ગત પરમાણુ પદ્ધતિઓ મોટે ભાગે અજ્ઞાત રહે છે.તે સામાન્ય રીતે સ્વીકારવામાં આવે છે કે ઘણા પ્રોટીન સંપૂર્ણ પ્રવૃત્તિને સુનિશ્ચિત કરવા માટે એક અથવા વધુ સાયટોકાઇન્સ સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે, તેથી ક્યાં તો ISG સીધી રીતે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે અથવા તેમની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા સેલ્યુલર પ્રોટીન દ્વારા મધ્યસ્થી કરવામાં આવે છે.ઉદાહરણ તરીકે, તાજેતરના ફોટોક્રોસલિંક્ડ પ્રોટીઓમિક્સ અભ્યાસમાં ATPase VCP/p97 ને મુખ્ય IFITM3 ક્રિયાપ્રતિક્રિયા ભાગીદાર તરીકે ઓળખવામાં આવે છે, જેનું નિષેધ વાયરલ કણો 14 સાથે IFITM3 ના લિસોસોમલ સોર્ટિંગ, ટર્નઓવર અને કોટ્રાન્સપોર્ટમાં ખામી તરફ દોરી જાય છે.ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશનનો ઉપયોગ કરીને, અમે VAPA, એક વેસિકલ-સંબંધિત પ્રોટીનને IFITM1/2/3 સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા ભાગીદાર તરીકે ઓળખી કાઢ્યું છે જે કોલેસ્ટ્રોલ-મધ્યસ્થી વાયરલ પરિપક્વતામાં મધ્યસ્થી કરે છે, અને યીસ્ટ ટુ-હાઇબ્રિડ સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરીને બીજા અભ્યાસ દ્વારા આની પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી.વૈજ્ઞાનિક આધાર 15 , 16 .
ચેપ અને જીવલેણ પરિવર્તનના દમનમાં સામેલ એક મૂળભૂત જૈવિક પ્રક્રિયા એ એન્ટિજેન પ્રસ્તુતિ છે, જે મુખ્ય હિસ્ટોકોમ્પેટિબિલિટી કોમ્પ્લેક્સ (MHC) પરમાણુઓ દ્વારા મધ્યસ્થી કરવામાં આવે છે.પેપ્ટાઇડ્સ (8-12 એમિનો એસિડ લાંબું) ક્લીવ્ડ, અકાળે સમાપ્ત અથવા ખોટી ફોલ્ડ પ્રોટીનમાંથી MHC-I હેટરોડાઇમરમાં લોડ થાય છે (MHC-I ભારે અને હળવા સાંકળો, જેને β-2-માઇક્રોગ્લોબ્યુલિન કહેવાય છે; β2M) 17,18 .પરિણામી સ્થિર MHC-I ટ્રીમર્સને કોષની સપાટી પર લઈ જવામાં આવે છે, જ્યાં તેઓ CD8+ T કોશિકાઓ (સાયટોટોક્સિક T કોશિકાઓ)17 માં અંતઃકોશિક પેપ્ટાઈડ્સ રજૂ કરે છે.ટી કોશિકાઓ આ પેથોજેન્સ અને ગાંઠ-વિશિષ્ટ એન્ટિજેન વહન કરતા કોષોને ઓળખે છે અને નાશ કરે છે.પરિણામે, રોગપ્રતિકારક દેખરેખ ટાળવા માટે પેથોજેન્સ અને ગાંઠ કોષો ઘણીવાર એન્ટિજેન પ્રસ્તુતિ પ્રક્રિયાને દબાવી દે છે.વધુમાં, માનવીય ગાંઠોના 40-90%માં MHC-Iનું નિયંત્રણ ઓછું થાય છે અને તે ઘણી વખત નબળા પૂર્વસૂચન સાથે સંકળાયેલું હોય છે.
પેથોજેન્સને પ્રતિભાવ આપવામાં સામેલ જનીનોએ આરામની સ્થિતિ અને સક્રિય ટ્રાન્સક્રિપ્શનની સ્થિતિ વચ્ચે ઝડપથી સ્વિચ કરવું જોઈએ.તેથી, ઘણા સેલ્યુલર પ્રોટીનને ટૂંકા ગાળામાં ઉચ્ચ IFN માંગના પ્રતિભાવમાં સામેલ હોવાનું અનુમાન કરવામાં આવે છે, જેમાં પ્રમોટર ક્રોમેટિન 20,21 ના ​​રિમોડેલિંગ અને ફેરફારનો સમાવેશ થાય છે.મોટાભાગના અભ્યાસોએ IFN ની હાજરીમાં વ્યક્તિગત ISG પ્રોટીન ભાગીદારોની ઓળખ પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કર્યું છે.મોડેલ સેલ સિસ્ટમ્સમાં કેટલાક પ્રોટીઓમિક અને ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક અભ્યાસોએ સેલ્યુલર લેન્ડસ્કેપ પર IFN ની અસરને સ્પષ્ટ કરી છે.જો કે, ઇન્ટરફેરોન દ્વારા પ્રેરિત ગતિશીલતાની વધતી જતી સમજ હોવા છતાં, અમે હજુ પણ ISG ની સંડોવણી વિશે થોડું જાણીએ છીએ.ઇન્ટરફેરોન સિગ્નલિંગની જટિલતા અને સમય-આધારિત ગતિશીલતાને ધ્યાનમાં લેતી વખતે, બે પ્રશ્નો ઉભા થાય છે: (i) શું ઝડપી સિગ્નલિંગમાં સામેલ મલ્ટિપ્રોટીન સંકુલને સ્થિર કરવું અને ફસાવવાનું શક્ય છે, અને (ii) શું આ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને 3D જગ્યામાં મેપ કરી શકાય છે?
આ મુદ્દાઓને સંબોધવા માટે, અમે IFNα-પ્રેરિત પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયા નેટવર્ક અને તેની ગતિશીલતાનો અભ્યાસ કરવા માટે માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (CLMS) સાથે મળીને disuccinimide સબરેટ-મીડિયેટેડ કેમિકલ ક્રોસ-લિંકિંગ (DSS) લાગુ કર્યું છે.ડીએસએસ વિવોમાં પ્રોટીન અને/અથવા પ્રોટીન સંકુલના પ્રોક્સિમલ અવશેષો વચ્ચે સહસંયોજક બોન્ડ ઉમેરે છે.અનુગામી MS વિશ્લેષણ ચોક્કસ ક્રોસલિંકિંગ સાઇટ્સ દર્શાવે છે જે ચોક્કસ પ્રોટીનની અંદરના પ્રદેશોની અવકાશી નિકટતાને પ્રતિબિંબિત કરે છે, જેને આંતરિક જોડાણ કહેવાય છે અથવા પ્રોટીન સંકુલમાં સબ્યુનિટ્સ કહેવાય છે, જેને આંતરસંબંધ કહેવાય છે.આ અભિગમનો ઉપયોગ કરીને, અમે ઘણા નવા પ્રોટીન-પ્રોટીન સંકુલ તેમજ ઇન્ટરફેરોન-પ્રેરિત મલ્ટીપ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયા નેટવર્કને ઓળખ્યા છે.આ નવી ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓના સબસેટનું વધુ પરીક્ષણ કરીને, અમે દર્શાવીએ છીએ કે H2BFS (H2B હિસ્ટોન-પ્રકાર FS; ત્યારપછી H2B તરીકે ઓળખવામાં આવે છે) અને MDN1 HLA-A માટે બંધનકર્તા ભાગીદારો તરીકે કાર્ય કરે છે.
ફ્લો-1 કોષો અન્નનળીના એડેનોકાર્સિનોમાના વિટ્રો મોડલમાં સૌથી વધુ જાણીતા છે કારણ કે તેઓ અન્નનળીની ગાંઠો 22,23ના મુખ્ય લક્ષણોની નકલ કરે છે.જો કે, તમામ ગાંઠો ઇમ્યુનોજેનિક હોતા નથી, અને Flo-1 કોષો ઇન્ટરફેરોન સારવારને પ્રતિભાવ આપે છે કે કેમ તે નિર્ધારિત કરવા માટે, અમે Flo-1 કોષોને 10 ng/ml IFNα સાથે 72 કલાક સુધી સારવાર આપી.ફ્લો-1 કોષોએ pSTAT1 અને IRF1 નું પ્રારંભિક ઇન્ડક્શન દર્શાવ્યું હતું, જે સારવારના 2 કલાક પછી શરૂ થાય છે અને 72 કલાક સુધી ચાલુ રહે છે, જેમાં IRF1 (આકૃતિ 1A) ના સ્થિર સ્તરોમાં સમય-આધારિત ઘટાડો થાય છે.ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2, અને ISG15) 6 કલાક પછી મજબૂત રીતે પ્રેરિત હોવાનું જણાયું હતું, જે IFNα (આકૃતિ 1A) ના ક્લાસિક મધ્ય અને અંતના તબક્કાના પ્રતિભાવોની નકલ કરે છે.એકસાથે, આ ડેટા સૂચવે છે કે આ સેલ્યુલર મોડેલનો ઉપયોગ ઇન્ટરફેરોન પ્રતિભાવોનો અભ્યાસ કરવા માટે થઈ શકે છે.
IFNα સારવાર પછી Flo-1 કોષોમાં વિભેદક પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ પ્રતિસાદ.(A) 2, 6, 24, 48 અને 72 કલાક માટે 10 ng/ml IFNα સાથે સારવાર કરાયેલ Flo-1 કોષોમાં પ્રોટીન અભિવ્યક્તિનું ઇમ્યુનોબ્લોટ દ્વારા સૂચવેલ ISG એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ કરીને વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.(B) દર્શાવેલ સમય અને સાંદ્રતા માટે DSS સાથે ક્રોસ-લિંક કર્યા પછી સંપૂર્ણ કોષના અર્કના Coomassie વાદળી રંગના SDS-PAGE જેલ્સ.(C) પ્રોટીન ક્રોસ-લિંકિંગની ડિગ્રીનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે સમાન નમૂનામાંથી p53(DO-1) એન્ટિબોડી સાથે પ્રતિનિધિ ઇમ્યુનોબ્લોટની તપાસ કરવામાં આવી.
ઇન સિટુ પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાના લેન્ડસ્કેપને મેળવવા માટે, અમે DSS નો ઉપયોગ કર્યો, જે તેની ઉચ્ચ પટલની અભેદ્યતા અને પ્રમાણમાં ટૂંકા પ્રતિક્રિયા સમયને કારણે વ્યાપકપણે ઉપયોગમાં લેવાતું ક્રોસ-લિંકિંગ એજન્ટ છે.ટૂંકા પ્રતિક્રિયા સમય ક્રોસલિંક્ડ પ્રોટીનના મોટા એકત્રીકરણને રોકવામાં મદદ કરે છે, ત્યાં ક્રોસલિંકરની સ્થિરતા જાળવી રાખે છે.શ્રેષ્ઠ DSS સાંદ્રતા નક્કી કરવા અને ઓવર-ક્રોસલિંકિંગ ટાળવા માટે, અમે સૌપ્રથમ કોષોને અનુક્રમે 5, 10, 5 અને 30 મિનિટ માટે 5, 2.5 અને 1 mM DSS પર ખુલ્લા પાડ્યા અને Coomassie-stained SDS-PAGE દ્વારા lysatesનું વિશ્લેષણ કર્યું. (ડેટા બતાવેલ નથી).સેલ લિસેટ્સ સૌથી ઓછી સાંદ્રતા પર અને સૌથી ઓછા સમયના બિંદુએ અત્યંત ક્રોસ-લિંક્ડ હોવાનું જણાય છે.તેથી, ડીએસએસને 5 મિનિટમાં 1, 0.5 અને 0.1 એમએમ પર ટાઇટ્રેટ કરવામાં આવ્યું હતું (આકૃતિ 1B).5 મિનિટ માટે 0.5 એમએમ ડીએસએસ સાથે શ્રેષ્ઠ ક્રોસલિંકીંગ જોવામાં આવ્યું હતું, અને આ શરતો IFNα સાથે સારવાર કરાયેલા કોષો માટે પસંદ કરવામાં આવી હતી.વધુમાં, આકૃતિ 1C પ્રોટીન ક્રોસ-લિંકિંગની ડિગ્રીનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે p53 (DO-1) એન્ટિબોડીનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવેલ વેસ્ટર્ન બ્લૉટ દર્શાવે છે.
Flo-1 કોષોને ક્રોસલિંકર ઉમેરતા પહેલા 24 કલાક માટે 10 ng/ml IFNα સાથે સારવાર આપવામાં આવી હતી.ક્રોસ-લિંક્ડ કોશિકાઓ પછીથી દ્વિ-પગલાંના પ્રોટીઓલિસિસ દ્વારા લિઝ્ડ કરવામાં આવ્યા હતા અને FASP (ફિગ. 2)24,25 દ્વારા પ્રોટીનની પ્રક્રિયા કરવામાં આવી હતી.ક્રોસ-લિંક્ડ ટ્રિપ્ટિક પેપ્ટાઇડ્સનું માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (ફિગ. 2) દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.MS/MS સ્પેક્ટ્રા પછી પ્રોટીન ક્રમ સાથે મેળ ખાય છે અને MaxQuant26,27 સાથે માપવામાં આવે છે.SIM-XL પ્રોગ્રામનો ઉપયોગ કરીને મેળવેલા સ્પેક્ટ્રામાંથી ક્રોસ-લિંક્ડ પેપ્ટાઇડ્સ ઓળખવામાં આવ્યા હતા, અને વ્યક્તિગત સંયોજનોને xQuest28 અને SIM-XL29 ઓપન સોર્સ કમ્પ્યુટિંગ સોફ્ટવેર પાઇપલાઇન્સ (ફિગ. 2) નો ઉપયોગ કરીને જટિલ નેટવર્કમાં જોડવામાં આવ્યા હતા.સિમ-એક્સએલ પ્રોટીન-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ, આંતરિક સાંકળો અને વ્યક્તિગત સાંકળોને સરળ અથવા જટિલ પ્રોટીન મિશ્રણમાં ઓળખે છે અને પ્રોટીન માળખામાં ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ જોવા માટે સ્ક્રિપ્ટો પ્રદાન કરે છે.વધુમાં, તે દરેક ક્રોસ-રેફરન્સને MS/MS29 સ્પેક્ટ્રમ ગુણવત્તા અનુસાર ID સ્કોર તરીકે રેન્ક આપે છે.કેટલાક અત્યંત વિશ્વસનીય પ્રોટીન-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ અને સંકુલોને ઓળખવામાં આવ્યા છે, અને પરમાણુ ગતિશીલતા (MD) મોડેલિંગ (ફિગ. 2) 30, 31 નો ઉપયોગ કરીને કો-ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન અને સંકુલના રચનાત્મક ફેરફારોનો ઉપયોગ કરીને ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓના નવા સમૂહની વધુ તપાસ કરવામાં આવી છે.
CLMS પદ્ધતિની યોજનાકીય ઝાંખી.Flo-1 કોષોને 24 કલાક માટે 10 ng/ml IFNα સાથે સારવાર આપવામાં આવી હતી, ત્યારબાદ DSS નો ઉપયોગ કરીને સીટુ પ્રોટીન ક્રોસ-લિંકિંગ અને ત્યારબાદ સેલ લિસિસ અને ટ્રિપ્સિનાઇઝેશન દ્વારા.ઓર્બિટ્રેપ માસ સ્પેક્ટ્રોમીટરનો ઉપયોગ કરીને ક્રોસ-લિંક્ડ નમૂનાઓનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું અને એલસી-એમએસ/એમએસ દરમિયાન પેપ્ટાઇડ પ્રિકર્સર્સના ફ્રેગમેન્ટેશન માટે વધુ નમૂના લેવામાં આવ્યા હતા.ક્રોસલિંક્ડ પેપ્ટાઇડ્સ (SIM-XL) પ્રોગ્રામના સ્પેક્ટ્રમ રેકગ્નિશન મશીનનો ઉપયોગ કરીને મેળવેલા સ્પેક્ટ્રામાંથી બે લિંક્ડ પેપ્ટાઇડ્સ ઓળખવામાં આવ્યા હતા, અને તમામ સંયોજનોને કોમ્પ્યુટેશનલ પાઇપલાઇન્સનો ઉપયોગ કરીને જટિલ નેટવર્કમાં જોડવામાં આવ્યા હતા.ખોટા હકારાત્મક દર (FDR) સ્કોર્સ પર આધારિત ઓછી આત્મવિશ્વાસની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને ફિલ્ટર કરો.કો-ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશનનો ઉપયોગ કરીને કેટલીક નવી હાઇ-ફિડેલિટી પ્રોટીન-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓની વધુ પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી, અને મોલેક્યુલર ડાયનેમિક્સ (MD) મોડેલિંગનો ઉપયોગ કરીને સંકુલમાં રચનાત્મક ફેરફારોની તપાસ કરવામાં આવી હતી.
કુલ ~30,500 અને ~28,500 પેપ્ટાઇડ્સ અનુક્રમે અનસ્ટિમ્યુલેટેડ અને સ્ટિમ્યુલેટેડ IFNα નમૂનાઓમાં MaxQuant નો ઉપયોગ કરીને શોધી કાઢવામાં આવ્યા હતા (પૂરક કોષ્ટક S1, ફિગ. 3A).બંને કિસ્સાઓમાં પેપ્ટાઈડ લંબાઈનું વિતરણ મોટા પેપ્ટાઈડ્સનું ઊંચું પ્રમાણ દર્શાવે છે, જે ક્રોસ-લિંક્ડ પેપ્ટાઈડ્સની હાજરી સૂચવે છે (ફિગ. 3B,C).વધુમાં, IFNα-સારવાર કરાયેલા નમૂનાઓ (ફિગ. 3C) માં 40-55 રેન્જમાં મોટા પેપ્ટાઈડ્સનો મોટો હિસ્સો હાજર હતો.લોગ2 ની તીવ્રતા સામે પ્રોટીન મેપિંગ દર્શાવે છે કે ક્લાસિક ઇન્ટરફેરોન-ઉત્તેજિત પ્રોટીન MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58, અને HLA-F (આકૃતિ 3D) સહિત સારવાર ન કરાયેલ નમૂનાઓની તુલનામાં સૌથી વધુ વિપુલ પ્રમાણમાં હતા.રિએક્ટોમ પાથવે ડેટાબેઝનો ઉપયોગ કરીને IFNα સારવારના પ્રતિભાવમાં ત્રણ ગણાથી વધુ સમૃદ્ધ પ્રોટીન માટેના માર્ગોનું વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે MHC-I-મધ્યસ્થી એન્ટિજેન પ્રસ્તુતિ અને પ્રક્રિયા એ સૌથી પ્રબળ માર્ગ (આકૃતિ 3E) હતો.અગાઉના અહેવાલો સાથે સુસંગત, OAS અને ISG15 તેમજ IFNα/β અને સાયટોકિન સિગ્નલિંગ દ્વારા મધ્યસ્થી કરાયેલ એન્ટિવાયરલ પ્રતિભાવો સક્રિય કરાયેલા માર્ગો પૈકીના હતા.વધુમાં, સિમ-એક્સએલનો ઉપયોગ કરીને મૂળ હસ્તગત MS/MS સ્પેક્ટ્રામાંથી લાયસિન- અને સેરીન-વિશિષ્ટ પ્રોટીન ક્રોસ-લિંક્સ ઓળખવામાં આવ્યા હતા.તાજેતરના અધ્યયનમાં 5 કોષ પ્રકારો9માં વ્યક્તિગત ISG ઓવરએક્સપ્રેશન અભ્યાસના મેટા-વિશ્લેષણ દ્વારા 9 વાયરસ વર્ગોમાંથી 20 વાઈરસ ફેલાયેલા 104 ISGs નો અહેવાલ છે.જો કે, મોટા ડેટાસેટ્સની સ્ક્રીનીંગની કોમ્પ્યુટેશનલ મર્યાદાઓને દૂર કરવા માટે, અમે પાદરિયા એટ અલ. દ્વારા અહેવાલ કરાયેલ IRDS જનીનોની સૂચિ વચ્ચે સંભવિત ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ શોધવા માટે નાના ડેટાસેટ સાથે શરૂઆત કરી છે, જેમાંથી મોટાભાગના ISG છે.
IFNα (MaxQuant માંથી મેળવેલ ડેટા) ના પ્રતિભાવમાં વિભિન્ન રીતે વ્યક્ત કરાયેલ ક્રોસ-લિંક્ડ પ્રોટીનની ઓળખ.(A) IFNα14 સારવાર કરેલ અને સારવાર ન કરાયેલ Flo-1 નમૂનાઓમાં ઓળખાયેલ સામાન્ય અને વિશિષ્ટ પેપ્ટાઈડ્સની સંખ્યાનું પ્રતિનિધિત્વ કરતું વેન ડાયાગ્રામ.સારવાર ન કરાયેલ (B) અને IFNα સારવાર કરેલ (C) ક્રોસલિંક કરેલ નમૂનાઓનું પેપ્ટાઇડ લંબાઈ વિતરણ.(D) સારવાર ન કરાયેલ અને IFNα14 ટ્રીટેડ Flo-1 કોષો વચ્ચે લોગ2 (LFQ તીવ્રતા) રજૂ કરતો હીટ મેપ.ડાબી પેનલ IFNα ની હાજરીમાં સૌથી વધુ સક્રિય રીતે સક્રિય થયેલ પ્રોટીન દર્શાવે છે.(E) IFNα સારવાર પછી 20 મુખ્ય સંવર્ધન માર્ગોનું પ્રતિનિધિત્વ કરતું હિસ્ટોગ્રામ.રિએક્ટોમ પાથવે ડેટાબેસે અપરેગ્યુલેટેડ IFNα-પ્રતિભાવ પ્રોટીનમાં ચાર ગણા કરતાં વધુ ફેરફારોનું વિશ્લેષણ કર્યું.
ઇન્ટરફેરોન-મધ્યસ્થી ISG ઉત્તેજના સારી રીતે દસ્તાવેજીકૃત થયેલ છે, પરંતુ પરમાણુ સ્તરે તે નબળી રીતે સમજી શકાય છે કે આ પ્રોટીન જૈવિક કાર્યોની વિશાળ શ્રેણીમાં કેવી રીતે પરિણમે છે.અમે જાણીતા ISGs વચ્ચે ઉચ્ચ સ્તરના વિશ્વાસ સાથે પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓની તપાસ કરી.રસપ્રદ વાત એ છે કે, અમે MX1, USP18, ROBO1, OAS3 અને STAT1 પ્રોટીન સહિત એક નેટવર્કને ઓળખ્યું છે જે IFNα સારવાર (આકૃતિ 4, કોષ્ટક S2) 32,33,34ના પ્રતિભાવમાં એક વિશાળ સંકુલ બનાવે છે.સૌથી અગત્યનું, આ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ IFNα સાથે સારવાર કરાયેલા તમામ ત્રિપુટીઓમાં જોવા મળી હતી અને સારવાર ન કરાયેલ નમૂનાઓમાં મળી ન હતી, જે સૂચવે છે કે તેઓ ખાસ કરીને IFNα સારવારના પ્રતિભાવમાં રચાયા હતા.તે જાણીતું છે કે STAT1 ટ્રાંસ્ક્રિપ્શનલી આ ISGs ની અભિવ્યક્તિનું નિયમન કરે છે, પરંતુ પ્રોટીન સ્તરે ISGs સાથે તેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાનો અભ્યાસ કરવામાં આવ્યો નથી.STAT1 નું સ્ફટિક માળખું દર્શાવે છે કે તેનું હેલિકલ ડોમેન (CCD) ડીએનએ અથવા પ્રોટોમર્સ સાથેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયામાં ડાયમર્સ 35 ની રચના દરમિયાન સામેલ નથી.આ α-હેલિસિસ એક હેલિકલ હેલિક્સ માળખું બનાવે છે જે ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ થવા માટે મુખ્યત્વે હાઇડ્રોફિલિક સપાટી વિસ્તાર પૂરો પાડે છે 35.અમારા CLMS ડેટામાં, અમે અવલોકન કર્યું છે કે STAT1 સાથેની મોટાભાગની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ CCD, લિંકર ડોમેન અથવા C-ટર્મિનલ ટેલ (અવશેષો 700-708) (આકૃતિ 4A) પહેલાના SH2 ડોમેનમાં થઈ હતી.અગાઉના અભ્યાસમાં જણાવાયું હતું કે USP18 STAT2 ના CCD અને DNA-બાઈન્ડિંગ ડોમેન (DBD) સાથે જોડાય છે અને પ્રકાર I ઇન્ટરફેરોન સિગ્નલિંગ 24 ના અવરોધને મધ્યસ્થી કરવા માટે પ્રકાર I ઇન્ટરફેરોન રીસેપ્ટર IFNAR2 ના સબ્યુનિટમાં ભરતી કરવામાં આવે છે.અમારા ડેટાએ એ પણ દર્શાવ્યું છે કે USP18 ઉત્પ્રેરક ડોમેન STAT1 DBD (આકૃતિ 4A,D) સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે, જે સૂચવે છે કે STAT1 અને STAT2 બંને USP18 ને IFNAR2 તરફ આકર્ષવામાં ભૂમિકા ભજવી શકે છે.
IFNα સાથે સારવાર કરાયેલ ક્રોસ-લિંક્ડ કોષોમાં પ્રોટીન-પ્રોટીન ISG નેટવર્ક ઓળખાય છે.(A) 2D ક્રિયાપ્રતિક્રિયા પ્લોટ પ્રોટીન-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ (SIM-XL પ્રોગ્રામમાં જનરેટ થયેલ) દર્શાવે છે, જેમાં ઇન્ટરમોલેક્યુલર ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ રજૂ કરતી રેખાઓ (ક્રોસલિંક કટઓફ 3.5 પર સેટ છે).વિવિધ ઓળખના ડોમેન્સ તેમના રંગ દ્વારા ચિહ્નિત થયેલ છે32: MX1 ડોમેન, ડાયનામિન_એન (73–249), ડાયનામિન_એમ (259–547), અને GED (569–660).OAS3 ડોમેન્સ: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), અને OAS1_C (903-108).ડોમેન ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) અને fn3 (777–864).STAT1 ક્ષેત્રો: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), અને STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) અનુક્રમે વાદળી અને લાલ રંગમાં લેબલ થયેલ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ અને ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ સાથે ક્રોસ-લિંક્ડ પ્રોટીન (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 અને STAT1) ના પરિપત્ર દર્શક.ક્રોસ-લિંક થ્રેશોલ્ડ 3.5 પર સેટ કરવામાં આવી હતી.ડોટ પ્લોટ્સ MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), અને OAS3 (F), તેમજ બે પેપ્ટાઇડ્સ વચ્ચેના K અથવા S ક્રિયાપ્રતિક્રિયા સાઇટ્સ સાથે STAT1 ક્રિયાપ્રતિક્રિયા સાઇટ્સ સૂચવે છે.આકૃતિમાં, ક્રોસ-લિંક સ્કોર થ્રેશોલ્ડ 3.0 પર સેટ છે.(G) STAT1 અને OAS3 DI ડોમેન્સ વચ્ચેની વિવિધ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા સાઇટ્સ PyMol (PyMOL મોલેક્યુલર ગ્રાફિક્સ સિસ્ટમ, વર્ઝન 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) અને OAS3 (pdb id: 4s3n34).) કાર્યક્રમ.
મનુષ્યોમાં USP18 ના બે આઇસોફોર્મ્સનું વર્ણન કરવામાં આવ્યું છે, એક પૂર્ણ-લંબાઈનું પ્રોટીન જે મુખ્યત્વે ન્યુક્લિયસમાં સ્થિત છે, અને એન-ટર્મિનલ ડોમેન વિનાનું આઇસોફોર્મ, USP18-sf, જે સાયટોપ્લાઝમ અને ન્યુક્લિયસ 36માં સમાનરૂપે વિતરિત થાય છે.વધુમાં, N-ટર્મિનસ અસંગઠિત હોવાનું અનુમાન કરવામાં આવ્યું હતું અને તેને આઇસોપેપ્ટીડેઝ પ્રવૃત્તિ અથવા ISG1537 બંધનકર્તાની જરૂર નથી.અમારા અભ્યાસમાં ઓળખવામાં આવેલી મોટાભાગની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ પ્રોટીનના N-ટર્મિનસ પર સ્થિત હતી, જે સૂચવે છે કે આ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓમાં પૂર્ણ-લંબાઈના USP18 (આકૃતિ 4A,D)નો સમાવેશ થાય છે અને તેથી સંભવતઃ ન્યુક્લિયસમાં થાય છે.વધુમાં, અમારો ડેટા એ પણ સૂચવે છે કે N-ટર્મિનસ પ્રોટીન-થી-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ માટે વિશિષ્ટ છે.IFNAR2 બાઇન્ડિંગ સાઇટ અવશેષો 312-368 વચ્ચે સ્થિત છે, અને ખાસ કરીને, જટિલમાંના કોઈપણ પ્રોટીન આ પ્રદેશ સાથે જોડાતા નથી (ફિગ. 4A) 37,38 .એકસાથે લેવાયેલ આ ડેટા સૂચવે છે કે IFNAR2 બંધનકર્તા ડોમેનનો ઉપયોગ ફક્ત રીસેપ્ટર પ્રોટીન દ્વારા કરવામાં આવે છે.વધુમાં, માત્ર OAS3 અને ROBO1 જ N-ટર્મિનસ અને IFNAR2 બંધનકર્તા સાઇટ (આકૃતિ 4A) ના અપસ્ટ્રીમ ડોમેન્સ સાથે સંકળાયેલા હોવાનું જણાયું હતું.
ROBO1 એ ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન સિગ્નલિંગ પરમાણુઓના ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન (Ig) સુપરફેમિલીનું છે અને તેમાં પાંચ Ig ડોમેન્સ અને એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર પ્રદેશમાં ત્રણ ફાઈબ્રોનેક્ટીન (Fn) ડોમેન્સનો સમાવેશ થાય છે.આ એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર ડોમેન્સ મેમ્બ્રેન-પ્રોક્સિમલ રિજન અને સિંગલ ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન હેલિક્સ દ્વારા અનુસરવામાં આવે છે 39. એક અસંરચિત અંતઃકોશિક પ્રદેશ સી-ટર્મિનસ પર સ્થિત છે અને તેમાં સંરક્ષિત સિક્વન્સ મોટિફ્સ છે જે અસરકર્તા પ્રોટીન બંધનને મધ્યસ્થી કરે છે.એમિનો એસિડ ~1100 થી 1600 સુધીનો વિસ્તાર મોટાભાગે અવ્યવસ્થિત છે.અમે જોયું કે MX1 ROBO1 સાથે Ig, Fn અને અંતઃકોશિક ડોમેન્સ દ્વારા ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે, જ્યારે STAT1 સાથેની મોટાભાગની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ તેના CCD, લિંકર ડોમેન અને ROBO1 (ફિગ. 4A,E) ના C-ટર્મિનસ વચ્ચે થાય છે.બીજી બાજુ, DI, DIII, અને OAS3 લિંકર પ્રદેશો સાથેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ સમગ્ર ROBO1 પ્રોટીન (ફિગ. 4A)માં વહેંચવામાં આવી હતી.
ઓલિગોએડેનીલેટ સિન્થેઝ (ઓએએસ) પ્રોટીન ફેમિલી ઇન્ટ્રાસેલ્યુલર ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ આરએનએ (ડીએસઆરએનએ) સ્વીકારે છે અને બાંધે છે, રચનાત્મક ફેરફારોમાંથી પસાર થાય છે, અને 2′,5′-લિંક્ડ ઓલિગોએડેનિલેટ્સ (2-5 તરીકે) 40 નું સંશ્લેષણ કરે છે.એવું જાણવા મળ્યું હતું કે ત્રણ OAS પૈકી, OAS3 dsRNA માટે સૌથી વધુ આકર્ષણ દર્શાવે છે અને ઓછામાં ઓછા 2-5 As નું સંશ્લેષણ કરે છે, જે RNase L ને સક્રિય કરી શકે છે અને તેથી વાયરલ પ્રતિકૃતિ 41 ને મર્યાદિત કરી શકે છે.OAS પરિવારમાં પોલિમરેઝ બીટા (pol-β) જેવા ન્યુક્લિયોટાઇડ ટ્રાન્સફરસે ડોમેન્સનો સમાવેશ થાય છે.અગાઉના સંશોધનોએ દર્શાવ્યું છે કે C-ટર્મિનલ ડોમેન (DIII) ની ઉત્પ્રેરક પ્રવૃત્તિ dsRNA- બંધનકર્તા ડોમેન (DI) પર આધારિત છે, જે OAS342 ના સક્રિયકરણ માટે જરૂરી છે.અમે અવલોકન કર્યું છે કે OAS3 ના DI અને DII ડોમેન્સ CCD અને SH2 અને STAT1 TAD (આકૃતિ 4A,F) વચ્ચેના નાના જંકશન પ્રદેશ સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે.પ્રોટીન સ્ટ્રક્ચર પર વિવિધ ક્રોસલિંકિંગ સાઇટ્સને ઓવરલે કરવાથી β-શીટ અને DBD STAT1 લૂપ અને OAS3 (ફિગ. 4G) ના DI ડોમેનમાં 60-75 અવશેષો દ્વારા રચાયેલ ખુલ્લા ખિસ્સા અથવા પોલાણ વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા બહાર આવી છે.સંકુલમાં પ્રોટીનની દિશા એ પણ દર્શાવે છે કે OAS3 સાથેની કોઈપણ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા તેના DI ડોમેન (ફિગ. S1A) ની DNA-બંધન ક્ષમતામાં દખલ કરતી નથી.વધુમાં, GTPase MX1 નું N-ટર્મિનલ ડોમેન OAS3 (Fig. 4A) ના DI અને DIII ડોમેન્સ સાથે વ્યાપક રીતે સંપર્ક કરે છે.અમે ત્રણેય IFNα-સારવાર કરેલ પુનરાવર્તનોમાં OAS1 અને MX1 વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાનું અવલોકન પણ કર્યું, જ્યાં એક OAS1 ડોમેન (ઉત્પ્રેરક રીતે સક્રિય પણ) ત્રણેય MX1 ડોમેન્સ (આકૃતિ S2A,B) સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે.
એમએક્સ પ્રોટીન ડાયનીન જેવા જીટીપીસેસના વિશાળ પરિવારનો એક ભાગ છે જેમાં એન-ટર્મિનલ જીટીપીઝ ડોમેન છે જે જીટીપીને બાંધે છે અને હાઇડ્રોલાઇઝ કરે છે, એક મધ્યવર્તી ડોમેન જે સ્વ-એસેમ્બલીમાં મધ્યસ્થી કરે છે અને સી-ટર્મિનલ લ્યુસીન ઝિપર જે જીટીપીઝ (એલઝેડ) તરીકે કાર્ય કરે છે. ).ડોમેન ઇફેક્ટર ડોમેન 25,43.MX1 વાયરલ જનીન 43 ના ટ્રાન્સક્રિપ્શનને અવરોધિત કરવા માટે વાયરલ પોલિમરેસિસના સબ્યુનિટ્સ સાથે જોડાય છે.અગાઉ નોંધાયેલ યીસ્ટ ટુ-હાઇબ્રિડ સ્ક્રીન દર્શાવે છે કે PIAS1-સંબંધિત MX1 DNA-બંધનકર્તા પ્રવૃત્તિને અવરોધિત કરીને STAT1-મધ્યસ્થી જનીન સક્રિયકરણને અટકાવે છે અને તેમાં SUMO E344,45 ligase પ્રવૃત્તિ પણ છે.અહીં, અમે દર્શાવીએ છીએ કે MX1 STAT1 (આકૃતિ 4C,D) સાથે જોડાય છે, જો કે આ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા IFNα ના પ્રતિભાવમાં STAT1-મધ્યસ્થી જનીન સક્રિયકરણને કેવી રીતે અસર કરે છે તેના વધુ અભ્યાસની જરૂર છે.વધુમાં, અમે એ પણ જોયું કે MX1 એ IFIT3 અને DDX60 સાથે ત્રણેય IFNα-સારવાર કરેલ પુનરાવર્તનો (ફિગ. S2C) માં ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરી હતી.
DDX60 એ IFN-પ્રેરિત સાયટોપ્લાઝમિક હેલિકેસ છે જે અગાઉ વાયરલ RNA46 ના RIG-I-સ્વતંત્ર અધોગતિમાં ભૂમિકા ભજવતો હોવાનું નોંધાયું છે.તે RIG-I સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે અને લિગાન્ડ-વિશિષ્ટ રીતે તેના સિગ્નલિંગને સક્રિય કરે છે 46. DDX60 એ DEXD/H-Box હેલિકેસ ડોમેન અને સી-ટર્મિનલ હેલિકેસ ડોમેનનો સમાવેશ કરે છે જે વાયરલ RNA અને DNA47ને જોડે છે.MX1 અને IFIT3 સાથે તેની મોટાભાગની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ કેનોનિકલ ડોમેન્સ અથવા મોટિફ્સ (ફિગ. S2E,F) વિના લાંબા N- અને C-ટર્મિનલ પ્રદેશોમાં થાય છે.જો કે, MX1 એ DEXD/H-Box હેલિકેસ ડોમેન (ફિગ. S2E) સાથે પણ સંકળાયેલું છે.IFIT પરિવારના પ્રોટીનમાં ટેટ્રાપેપ્ટાઇડ રીપીટ (TPR) તરીકે ઓળખાતા વિશિષ્ટ હેલિક્સ-ટર્ન-હેલિક્સ મોટિફની ટેન્ડમ નકલો હોય છે.IFIT3 એ RIG-I સિગ્નલિંગનું હકારાત્મક મોડ્યુલેટર હોવાનું જણાયું હતું અને તેથી MAVS કોમ્પ્લેક્સનું એક ઘટક છે.એકસાથે લેવામાં આવે તો, અમારો ડેટા સૂચવે છે કે IFIT3 અને DDX60 મુખ્યત્વે IFIT3 ના TPR 3-6 વચ્ચેના પ્રદેશમાં ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે અને RIG-I/MAVS સિગ્નલિંગ (ફિગ. S2F) માં ભૂમિકા ભજવી શકે છે.
આપેલ છે કે સમગ્ર પ્રોટીઓમનું સ્ક્રીનીંગ કોમ્પ્યુટેશનલી સઘન છે, ત્યારબાદ અમે IFNα-સારવાર કરેલ પુનરાવર્તનોમાંથી એકની હાજરી માટે સમગ્ર માનવ યુનિપ્રોટ ડેટાબેઝની તપાસ કરી.આ પ્રતિકૃતિમાં, અમને HLA-A માટે ઘણા અત્યંત વિશ્વસનીય ક્રિયાપ્રતિક્રિયા નેટવર્ક મળ્યાં છે.એમએસ/એમએસ સ્પેક્ટ્રા દ્વારા ઓળખવામાં આવેલા પ્રોટીન પાથવેના વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે એમએચસી-આઈ-આધારિત એન્ટિજેન પ્રક્રિયા અને રજૂઆત એ ઇન્ટરફેરોન (ફિગ. 3D) દ્વારા પ્રેરિત મુખ્ય માર્ગ છે.તેથી, અમે MHC-I પરમાણુઓની પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓનો અભ્યાસ કરવા પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કર્યું છે જેમાં તમામ ક્રોસ-લિંક્ડ નમૂનાઓમાં ઉચ્ચ આત્મવિશ્વાસ છે.HLA માં α1, α2 અને α3 ડોમેન્સ અને પ્રકાશ સાંકળોનો સમાવેશ થાય છે, અને માઇક્રોગ્લોબ્યુલિન β2 (β2m) એ સતત ચેપરોન પ્રોટીન છે49.એકવાર એન્ડોપ્લાઝમિક રેટિક્યુલમમાં એસેમ્બલ થઈ ગયા પછી, પેપ્ટાઈડ લિગાન્ડ્સ50ની ગેરહાજરીમાં HLA અસ્થિર છે.પેપ્ટાઇડ-બંધનકર્તા ગ્રુવ બિન-પેપ્ટાઇડ સ્વરૂપમાં અત્યંત પોલીમોર્ફિક અને અનસ્ટ્રક્ચર્ડ α1 અને α2 ડોમેન્સ અને પ્રમાણમાં ઓછા પોલીમોર્ફિક α351 ડોમેન દ્વારા રચાય છે.IFNα ની હાજરીમાં, અમે બે HLA-A સંકુલ શોધી કાઢ્યા: એક HMGA1 અને H2B (આકૃતિ 5, કોષ્ટક S3) સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે અને અન્ય MDN1, LRCH4 અને H2B (આકૃતિ 6) સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે.
IFNα H2B (H2BFS) અને HMGA1 સાથે HLA-A ક્રિયાપ્રતિક્રિયા નેટવર્કને પ્રેરિત કરે છે.(A) H2B-HLA-A-HMGA1 સંકુલમાં વિવિધ પ્રકારની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ દર્શાવતો 2D પ્લોટ (SIM-XL સોફ્ટવેરમાં જનરેટ થયેલો): ઇન્ટરલિંક (વાદળી), ઇન્ટરલિંક (લાલ) અને સિંગલ લિંક (બ્લેક)..વિવિધ ઓળખના ડોમેન્સ કલર કોડેડ 32 છે: H2B (હિસ્ટોન; 2–102) અને MHC-I (MHC_1; 25–203, જૂથ C1; 210–290 અને MHC_I_C; 337–364).ક્રોસ-લિંક થ્રેશોલ્ડ 3.5 પર સેટ કરવામાં આવી હતી.ડોટ પ્લોટ્સ H2B (B) અને HMGA1 (C) સાથે HLA-A ક્રિયાપ્રતિક્રિયા સાઇટ્સ, તેમજ બે પેપ્ટાઇડ્સ વચ્ચે K અથવા S ક્રિયાપ્રતિક્રિયા સાઇટ્સ સૂચવે છે.આકૃતિમાં, ક્રોસ-લિંક સ્કોર થ્રેશોલ્ડ 3.0 પર સેટ છે.(D) PyMOL પ્રોગ્રામમાં H2B, HLA-A અને HMGA1 પ્રોટીનની રચનામાં દર્શાવેલ પ્રોટીન વચ્ચેના સંબંધો.આ રચનાઓ Phyre2 સર્વર (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) નો ઉપયોગ કરીને મોડેલ કરવામાં આવી હતી અને H2B, HLA-A અને HMGA1 પ્રોટીન માટે ટેમ્પલેટ સ્ટ્રક્ચર્સ અનુક્રમે 1kx552, 1kj349 અને 2eze55 હતા.
IFNα H2B (H2BFS), MDN1 અને LRCH4 સાથે HLA-A ક્રિયાપ્રતિક્રિયા નેટવર્કને પ્રેરિત કરે છે.(A) 2D ઇન્ટરેક્ટિવ નકશા (SIM-XL સૉફ્ટવેરમાં જનરેટ થયેલ) પર MDN1 વર્તુળ તરીકે રજૂ કરવામાં આવેલ ઇન્ટ્રામોલેક્યુલર (લાલ) અને ઇન્ટરમોલેક્યુલર (વાદળી) ક્રોસલિંક.ક્રોસ-લિંક થ્રેશોલ્ડ 3.5 પર સેટ કરવામાં આવી હતી.વિવિધ ઓળખના ડોમેન્સ કલર કોડેડ 32 છે: H2B (હિસ્ટોન; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, જૂથ C1; 210–290 અને MHC_I_C; 337–364) અને LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) અને CH (535–641)).(B) PyMOL પ્રોગ્રામમાં H2B, HLA-A, LRCH4 અને MDN1 પ્રોટીનની રચનામાં દર્શાવેલ પ્રોટીન વચ્ચેના સંબંધો.આ રચનાઓ Phyre2 સર્વર (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) નો ઉપયોગ કરીને નમૂનારૂપ 1kx552, 1kj349, 6hlu62 અને 6i2665 સાથે H2B, HLA-A, LRCH4 અને MDN1 પ્રોટીન, અનુક્રમેH2B (C), LRCH4 (D), અને MDN1 (E) સાથે HLA-A માટે K અથવા S ક્રિયાપ્રતિક્રિયા સાઇટ્સ દર્શાવતા ડોટ પ્લોટ.પ્લોટ માટે, ક્રોસ-લિંક સ્કોર થ્રેશોલ્ડ 3.0 પર સેટ કરવામાં આવ્યો હતો.
જીનોમની અખંડિતતા જાળવવા ઉપરાંત, હિસ્ટોન H2B ટ્રાન્સક્રિપ્શનના નિયમનમાં પણ સામેલ છે.H2B પ્રોટીનમાં સેન્ટ્રલ હિસ્ટોન ડોમેન (HFD) નો સમાવેશ થાય છે જે ત્રણ α-હેલીસ દ્વારા લૂપ્સ દ્વારા અલગ કરવામાં આવે છે અને C-ટર્મિનલ પૂંછડી 41,52 છે.H2B સાથેની મોટાભાગની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા α1 હેલિક્સમાં થાય છે, જે HFD હેટરોડીમર (ફિગ. 5A,B) સાથે ટ્રિમરાઇઝેશન પ્રદાન કરે છે.જો કે લાયસિન ડીએનએ બંધનમાં સામેલ છે, કેટલાક લાયસિન વૈકલ્પિક એસિટિલેશન અથવા મેથિલેશન સાઇટ્સ પણ છે.ઉદાહરણ તરીકે, H2B ના અવશેષો K43, K46, અને K57 સીધા DNA બંધનમાં સામેલ નથી, પરંતુ વિવિધ પોસ્ટ-ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ ફેરફારોનું લક્ષ્ય છે.એ જ રીતે, H2B માં K44, K47 અને K57 અવશેષો IFNα ની હાજરીમાં વૈકલ્પિક ભૂમિકા ભજવી શકે છે, જેમાં અન્ય પ્રોટીન (ફિગ. 5A, B) સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયાનો સમાવેશ થાય છે.વધુમાં, એક્સ્ટ્રાક્રોમોસોમલ હિસ્ટોન H2B વિવિધ પ્રકારના કોષોમાં રોગપ્રતિકારક પ્રતિભાવને સક્રિય કરે છે, ચેપી એજન્ટો અથવા ક્ષતિગ્રસ્ત કોષોમાંથી મેળવેલા ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ DNA (dsDNA) ટુકડાઓ શોધવા માટે સાયટોસોલિક સેન્સર તરીકે કામ કરે છે54.ડીએનએ વાયરસની હાજરીમાં, H2B અવક્ષય IFN-β ઉત્પાદન અને STAT154 ફોસ્ફોરીલેશનને અટકાવે છે.H2B અન્ય કોર હિસ્ટોન્સ કરતાં વધુ ઝડપથી ન્યુક્લિયસની અંદર અને બહાર જવા માટે પણ જાણીતું છે54.MDN1 અને LRCH4 સાથે H2B ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ પણ પસંદ કરેલ સારવાર ન કરાયેલ નમૂનાઓમાં જોવા મળી હતી.અમને જાણવા મળ્યું કે HLA-A એ ત્રણેય IFNα-સારવાર નમુનાઓમાં અને એક સારવાર ન કરાયેલ પુનરાવર્તિત નમૂનામાં H2B સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરી હતી.આ ડેટા ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ નિયમનથી સ્વતંત્ર વૈકલ્પિક શારીરિક કાર્યમાં H2B ની ભૂમિકાને પ્રતિબિંબિત કરે છે.
HMGA1 (ઉચ્ચ ગતિશીલતા જૂથ AT-Hook 1), રોગને પ્રોત્સાહન આપતા એમિનો એસિડથી સમૃદ્ધ એક નાનું ન્યુક્લિયોપ્રોટીન, HLA-A સાથે જોડાણમાં ઓળખવામાં આવ્યું છે.તેની પાસે એસિડિક સી-ટર્મિનલ પૂંછડી અને ત્રણ અલગ ડીબીડી છે જેને AT હુક્સ કહેવાય છે કારણ કે તે dsDNA55,56 માં AT-સમૃદ્ધ પ્રદેશના નાના ખાંચો સાથે જોડાય છે.આ બંધન ડીએનએને વાળવા અથવા સીધા થવાનું કારણ બને છે, કેનોનિકલ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળોને તેના સર્વસંમતિ ક્રમને ઍક્સેસ કરવાની મંજૂરી આપે છે.સી-ટર્મિનલ પૂંછડી પ્રોટીન-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ અને ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળોની ભરતીમાં સામેલ હોવાનું માનવામાં આવે છે, કારણ કે સી-ટર્મિનલ કાઢી નાખવાના મ્યુટન્ટ્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન શરૂ કરવામાં અસમર્થ છે57.તદુપરાંત, આ ડોમેનમાં ઘણી સંરક્ષિત ફોસ્ફોરીલેશન સાઇટ્સ છે જે કિનાસેસ 58 માટે સબસ્ટ્રેટ તરીકે જાણીતા છે.અમે C-ટર્મિનલ ડોમેનની બહાર HMGA1 સાથે HLA-A અને H2B ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓનું અવલોકન કર્યું, જે સૂચવે છે કે C-ટર્મિનલ ડોમેન મુખ્યત્વે ટ્રાન્સક્રિપ્શન ફેક્ટર બંધનકર્તા (ફિગ. 5A, C) માટે વપરાય છે.એચએમજીએ પ્રોટીન એડેપ્ટર ડીએનએ સાથે જોડાવા માટે હિસ્ટોન H1 સાથે સ્પર્ધા કરે છે, જેનાથી સુલભતામાં વધારો થાય છે57.તેવી જ રીતે, એવું લાગે છે કે HMGA હિસ્ટોન H1 સાથે સ્પર્ધામાં લિંકર DNA સાથે હિસ્ટોન H2B સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે.HMGB1 ડેંડ્રિટિક કોષોમાં HLA-A, -B, અને -C ની અભિવ્યક્તિને પ્રેરિત કરે છે, જે તેમના સક્રિયકરણ તરફ દોરી જાય છે59, પરંતુ HMG અને HLA વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા અગાઉ નોંધવામાં આવી નથી.અમે જોયું કે HMGA1 HLA-A ના α1 અને α3 ડોમેન્સ સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે, તેના 3 DBD (આકૃતિ 5A,C) ની બહારની મોટાભાગની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ સાથે.અમારા હાથમાં, HLA-A ન્યુક્લિયસમાં સ્થાનીકૃત હોવાનું જણાયું હતું (ડેટા બતાવ્યા નથી), અને જોતાં કે H2B અને HMGA1 પણ ન્યુક્લિયસમાં હાજર છે, આ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા ન્યુક્લિયસમાં થાય છે.H2B, HLA-A, અને HMGA1 વચ્ચે માપવામાં આવેલા ચોક્કસ વ્યસન આકૃતિ 5D માં દર્શાવવામાં આવ્યા છે.
અન્ય પ્રોટીન સાથે HLA-A ની મોટાભાગની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ તેના α1 અને α2 ડોમેન્સ અને અવ્યવસ્થિત સી-ટર્મિનલ ડોમેન (ફિગ. 6) ની અંદર થાય છે.આમાંના એક ઉદાહરણમાં, અમે જોયું કે HLA-A LRCH4 (આકૃતિ 6A,D) ની અવ્યવસ્થિત N-ટર્મિનલ પૂંછડી સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે.LRCH4 TLR4 સક્રિયકરણ અને LPS સાયટોકાઇન ઇન્ડક્શનનું નિયમન કરે છે, ત્યાં જન્મજાત રોગપ્રતિકારક પ્રતિભાવ60,61 ને મોડ્યુલેટ કરે છે.તે એક મેમ્બ્રેન પ્રોટીન છે જેમાં નવ લ્યુસિન-સમૃદ્ધ રિપીટ્સ (LRRs) અને તેના એક્ટોડોમેનમાં કેલ્મોડ્યુલિન (CH) હોમોલોજી મોટિફ છે, ત્યારબાદ ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન ડોમેન (TMD) 60, 62 છે.CH ડોમેન્સ પ્રોટીન-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ 60 મધ્યસ્થી કરવા માટે નોંધવામાં આવ્યા છે.LRR અને CH ડોમેન્સ વચ્ચે લગભગ 300 એમિનો એસિડનો વિસ્તાર પ્રમાણમાં સુલભ છે પરંતુ અવ્યવસ્થિત છે.પ્રોટીન-પ્રોટીન નેટવર્ક અને વેસીક્યુલર ટ્રાન્સપોર્ટ 63 ના મધ્યસ્થી તરીકે અવ્યવસ્થિત પ્રદેશોના કાર્યના આધારે, અમે જોયું કે મોટાભાગની પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ અવ્યવસ્થિત પ્રદેશોમાં થાય છે.MDN1 સાથેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ LRR1, LRR6, CH ડોમેન્સ અને રેન્ડમ પ્રદેશો સહિત પ્રોટીનની સમગ્ર લંબાઈમાં વિતરિત કરવામાં આવી હતી, જ્યારે H2B મુખ્યત્વે CH ડોમેન (ફિગ. 6A, B) સાથે બંધાયેલ છે.નોંધનીય રીતે, કોઈપણ ક્રિયાપ્રતિક્રિયામાં TMJનો સમાવેશ થતો નથી, જે CLMS અભિગમની વિશિષ્ટતા સૂચવે છે (આકૃતિ 6A, B).
MDN1 ને HLA-A પ્રોટીન નેટવર્ક (આકૃતિ 6A) ના ભાગ તરીકે પણ ઓળખવામાં આવ્યું છે.તે પ્રોટીનના AAA કુટુંબ (વિવિધ પ્રવૃત્તિઓ સાથે સંકળાયેલ ATPases) સાથે સંબંધ ધરાવે છે.આ એ જ N-ટર્મિનલ AAA ડોમેન છે જે હેક્સામેરિક રિંગમાં ગોઠવાય છે અને 60S 64 રિબોસોમલ સબ્યુનિટમાંથી એસેમ્બલી ફેક્ટરને દૂર કરે છે.dynein64,65,66 જેવું જ જણાય છે.વધુમાં, Asp/Glu સમૃદ્ધ પ્રદેશ MIDAS ડોમેન (મેટલ આયન આધારિત સાઇટ) દ્વારા અનુસરવામાં આવે છે.MDN1 (લગભગ 5600 એમિનો એસિડ) ના મોટા કદ અને સારી રીતે અભ્યાસ કરેલ પ્રોટીન સાથે તેની મર્યાદિત હોમોલોજીને કારણે, માનવોમાં તેની રચના અને કાર્ય વિશે થોડું જાણીતું છે.અમે HLA-A, H2B, અને LRCH4 ને MDN1 બંધનકર્તા ભાગીદારો તરીકે ઓળખ્યા અને PyMol (ફિગ. 6A,B) માં પ્રોટીન કોમ્પ્લેક્સ તરીકે તેમનું અભિગમ જાહેર કર્યું.આ ત્રણ પ્રોટીન AAA ડોમેન, ડાયનીન જેવા લિંકર ડોમેન અને કદાચ MIDAS MDN1 ડોમેન સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે.અગાઉના અહેવાલમાં, બાઈટ પ્રોટીનના એફિનિટી શુદ્ધિકરણે MDN1 ને હિસ્ટોન H2B67 સાથે સંકળાયેલ પ્રોટીન તરીકે ઓળખાવ્યું હતું.આ ઉપરાંત, તાજેતરના અભ્યાસમાં HCT116 કોષોમાં MDN અને HLA-B વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાની પણ જાણ કરવામાં આવી છે, જે અમારા તારણો 68ને સમર્થન આપતા એફિનિટી-પ્યુરિફાઇડ માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રીનો ઉપયોગ કરે છે.IFNα-સારવાર કરાયેલા નમૂનાઓમાં આ સંકુલની ઓળખ ઇન્ટરફેરોન સિગ્નલિંગમાં MDN1 માટે ભૂમિકા સૂચવે છે.
કારણ કે HLA જનીનો અત્યંત પોલીમોર્ફિક છે, અમે Flo-1 કોષોના RNA સિક્વન્સિંગ ડેટામાંથી HLA-A, -B, અને -C મેપિંગના સિક્વન્સિંગ રીડ્સ કાઢ્યા (ડેટા બતાવ્યા નથી).સિક્વન્સિંગ રીડિંગ સાથે સુસંગત પેપ્ટાઇડ સિક્વન્સે HLA-A (આકૃતિ S3) માં ક્રોસ-લિંક્ડ પેપ્ટાઇડ્સ સ્થિત હતા તેવા પ્રદેશોમાં HLA-A, -B, અને -C વચ્ચે નોંધપાત્ર તફાવતો જાહેર કર્યા.વધુમાં, અમે H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 પ્રોટીન સાથે HLA-B/C પરમાણુઓના પ્રોટીન-ટુ-પ્રોટીન ક્રોસ-લિંકિંગનું અવલોકન કર્યું નથી.આ સૂચવે છે કે HLA-A, MDN1, LRCH1 અને HMGA1 વચ્ચે જોવા મળતી પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયા HLA-A વિશિષ્ટ છે.વધુમાં, બિન-ક્રોસલિંક્ડ નમૂનાઓ (ટેબલ S4) ના પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે HLA-A માં HLA-B અથવા HLA-C ની તુલનામાં ઉચ્ચ ક્રમ કવરેજ છે.HLA-A માટે ઓળખાયેલ પેપ્ટાઈડ્સ IFNα-સારવાર અને સારવાર ન કરાયેલ બંને નમૂનાઓમાં તીવ્રતામાં વધુ હતા.
અહીં ઓળખાયેલ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ નજીકના અવકાશી નિકટતામાં બે પ્રોટીનના બિન-વિશિષ્ટ ક્રોસ-લિંકિંગને કારણે ન હતી તેની ખાતરી કરવા માટે, અમે સહ-ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન એસે કરીને બે નવા HLA-A ક્રિયાપ્રતિક્રિયા પરિબળોની પુષ્ટિ કરી.અંતર્જાત MDN1 અને H2B સાથે HLA-A ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ IFNα-સારવાર અને સારવાર ન કરાયેલ ફ્લો-1 કોષો (આકૃતિ 7, આકૃતિ S4) બંનેમાં મળી આવી હતી.અમે પુષ્ટિ કરી છે કે HLA-A ને H2B દ્વારા ઇમ્યુનોપ્રિસિપેટ્સમાં કબજે કરવામાં આવ્યું હતું અને આ જોડાણ IFNα સારવારને કારણે હતું કારણ કે HLA-A સારવાર ન કરાયેલ કોષો (આકૃતિ 7A)માંથી ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેટ નમૂનાઓમાં ગેરહાજર હતું.જો કે, અમારો ડેટા સૂચવે છે કે IFNα ભિન્ન રીતે H2B અને MDN1 માટે HLA-A બંધનકર્તાને નિયંત્રિત કરે છે.IFNα H2B અને HLA-A વચ્ચેના જોડાણને પ્રેરિત કરે છે, પરંતુ MDN1 સાથેના જોડાણને ઘટાડે છે.અમે જોયું કે MDN1 નિયંત્રણોમાં HLA-A સાથે સંકળાયેલું હતું, અને IFNα ના ઉમેરાથી IFNα (આકૃતિ 7B,C) દ્વારા MDN1 ઇન્ડક્શનથી સ્વતંત્ર આ ક્રિયાપ્રતિક્રિયામાં ઘટાડો થયો.વધુમાં, HLA-A ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન એ A549 કોષો (ફિગ. S4) માં H2B કબજે કરે છે, જે સૂચવે છે કે આ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કોષના પ્રકારથી સ્વતંત્ર છે.એકસાથે લેવામાં આવે તો, આ પરિણામો H2B અને MDN1 સાથે HLA-A ની ઇન્ટરફેરોન-મધ્યસ્થી ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને સમર્થન આપે છે.
HLA-A H2B અને MDN1 ને સહ-શુદ્ધ કરે છે.પ્રતિનિધિ અંતર્જાત H2B (A) અને MDN1 (B) ઇમ્યુનોબ્લોટ્સને IFNα-સારવાર કરાયેલ Flo-1 કોષોમાંથી રોગપ્રતિકારક શક્તિ આપવામાં આવી હતી અને સૂચવેલ એન્ટિબોડીઝ માટે તપાસ કરવામાં આવી હતી.માઉસ અને સસલાના IgG નો ઉપયોગ નકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે થતો હતો.(C) વિવિધ એન્ટિજેન્સની સાપેક્ષ માત્રા (ઇનપુટ) દર્શાવેલ એન્ટિબોડીઝ સામે તપાસવામાં આવતા ઇમ્યુનોબ્લોટ્સ દ્વારા દર્શાવવામાં આવે છે, β-actin નો લોડિંગ નિયંત્રણ તરીકે ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.
ઇન્ટરફેરોન-પ્રેરિત અત્યંત વિશ્વસનીય ક્રોસ-લિંક્ડ નેટવર્ક, H2B-HLA-A-HMGA1 માંના એકના માળખાકીય ગુણધર્મોની તપાસ કરવામાં આવી હતી.અમે આ સંકુલમાં સામેલ પ્રોટીનની રચનાત્મક ગતિશીલતાને સમજવા માટે વૈકલ્પિક અભિગમ તરીકે મોલેક્યુલર ડાયનેમિક્સ મોડેલિંગનો ઉપયોગ કર્યો (આકૃતિ 8).CLMS ડેટાના અનુમાનો H2B, HLA-A અને HMGA1 પ્રોટીનની વિવિધ રચનાઓની શક્યતા સૂચવે છે.તેથી, નીચેના સંભવિત સંકુલોને દ્રાવક માધ્યમમાં મોડેલ કરવામાં આવ્યા હતા: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, અને H2B-HLA-A-HMGA1.MOE (મોલેક્યુલર ઓપરેટિંગ એન્વાયર્નમેન્ટ; કેમિકલ કોમ્પ્યુટીંગ ગ્રુપ ઇન્ક., મોન્ટ્રીયલ, ક્વિબેક, કેનેડા) પેકેજનો ઉપયોગ કરીને પ્રારંભિક પ્રોટીન-પ્રોટીન ડોકીંગ સ્ક્રીને આ પ્રોટીન (ફિગ. 8A) વચ્ચે ભિન્ન સંભવિત રચનાઓ સૂચવી.ડોકીંગ પ્રોટીન કોમ્પ્લેક્સના વિઝ્યુલાઇઝેશન દ્વારા ઘણી ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ અને સંભવિત રચનાઓ (આકૃતિ 5A, 8) જાહેર થઈ.આમ, એક સંભવિત રચના આકૃતિ 8A (લેબલવાળી ક્રોસ-લિંક સાથે) માં બતાવવામાં આવી છે અને MD મોડેલિંગ પાઇપલાઇનનો ઉપયોગ કરીને તેનું વધુ મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું.વધુમાં, H2B અથવા HMGA1 નું HLA-A સાથે બંધન HLA-A (ફિગ. 8A) માટે H2B ની ઉચ્ચ આકર્ષણને પ્રકાશિત કરે છે.
H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A, અને H2B-HLA-A-HMGA1 સંકુલ વચ્ચે સંભવિત નેટવર્ક્સની રચનાત્મક ગતિશીલતા.(A) ડાબી પેનલ એ ઇન્ટ્રામોલેક્યુલર (લાલ) અને ઇન્ટરમોલેક્યુલર (વાદળી) ક્રોસલિંક (ક્રોસલિંક કટઓફ 3.5 પર સેટ) નો 2D નકશો (SIM-XL સૉફ્ટવેરમાં જનરેટ) છે.વધુમાં, ઓળખાયેલ ક્રોસ-લિંકિંગ અવશેષો H2B, HLA-A, અને HMGA1 પ્રોટીનની રચનાઓ પર લેબલ કરવામાં આવે છે.આ પ્રોટીનની સંલગ્ન રચનાઓ MOE પેકેજમાં અમલી ડોકીંગ પાઇપલાઇનનો ઉપયોગ કરીને કાઢવામાં આવી હતી.નીચેની ડાબી પેનલ H2B-HLA-A અને HMGA1-HLA-A સંકુલના વિવિધ પ્રોટીન-પ્રોટીન બંધનકર્તા જોડાણો (GBVI/WSA dG; kcal/mol) ની વિવિધ સંભવિત રચનાઓ દર્શાવે છે.(B) દરેક પ્રોટીન સ્ટ્રક્ચર માટે અણુ સ્થાનો (હાઈડ્રોજન અણુઓને બાદ કરતાં) નું પ્રમાણભૂત વિચલન (RMSD).(C) સમયગાળો ≥ 10 ns ની ચોક્કસ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને ધ્યાનમાં લેતા વિવિધ સિમ્યુલેટેડ સંકુલમાંથી આંતરમોલેક્યુલર પ્રોટીન-પ્રોટીન હાઇડ્રોજન બોન્ડ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ.એચ-બોન્ડ ડોનર-એસેપ્ટર કટઓફ અંતર 3.5 Å પર સેટ કરવામાં આવ્યું હતું, અને દાતા-એચ-સ્વીકાર કરનાર કટઓફ એંગલ ≥ 160°–180° પર સેટ કરવામાં આવ્યો હતો.(D) તેમના સંબંધિત ભાગીદારો સાથે HLA-A પ્રોટીન-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ બનાવતા લેબલવાળા અવશેષો, ≥ 20 ns ફેલાયેલા, બનાવટી HLA-A-H2B અને HLA-A-HMGA1 સંકુલમાંથી કાઢવામાં આવે છે.પ્રોટીન સ્ટ્રક્ચર 100 ns MDS નું સરેરાશ માળખું દર્શાવે છે.(E) HLA-A-H2B અને HLA-A-HMGA1 સંકુલ વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ બે પેપ્ટાઇડ્સ વચ્ચેના K અથવા S ક્રિયાપ્રતિક્રિયા સાઇટ પર આધારિત 100 ns કરતાં વધુ H2B-HLA સિમ્યુલેશન દ્વારા ટ્રૅક કરાયેલ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓની તુલનામાં.સંકુલો /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.ક્રોસ-લિંક્સના મૂલ્યાંકન માટે થ્રેશોલ્ડ મૂલ્ય 3.0 પર સેટ કરવામાં આવ્યું હતું, અને ≥ 10 ns લેતી MDS તરફથી ચોક્કસ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને ધ્યાનમાં લેવામાં આવી હતી.BIOVIA ડિસ્કવરી સ્ટુડિયો (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) અને મોલેક્યુલર ઓપરેટિંગ એન્વાયર્નમેન્ટ (MOE; કેમિકલ કમ્પ્યુટિંગ ગ્રુપ ઇન્ક., મોન્ટ્રીયલ, ક્વિબેક, કેનેડા) પેકેજોનો ઉપયોગ કરીને પ્રોટીન સ્ટ્રક્ચરની કલ્પના કરવામાં આવી હતી.
સમય જતાં HLA-A પરમાણુઓની સ્થિરતા (માનક વિચલન; RMSD અથવા પ્રમાણભૂત વિચલન; RMSF) દર્શાવે છે કે સંકુલમાં H2B અથવા HMGA1 પ્રોટીનની હાજરી HLA-A (આકૃતિ 8B, આકૃતિ S5) ને સ્થિર કરે છે.HMGA1 પ્રોટીન HLA-A ની B2M સાઇટ સાથે ચુસ્તપણે જોડાય છે, HLA-A-HMGA1 અથવા H2B-HLA-A-HMGA1 સંકુલમાં HLA-A એમિનો એસિડની સ્થિરતા પ્રેરિત કરે છે (આકૃતિ 8B, આકૃતિ S5).ખાસ કરીને, HLA અવશેષો ~60-90 અને ~180-210 H2B (FIG. 8B) ની હાજરીમાં ઓછા લવચીક હોવાનું જણાયું હતું.H2B અને HMGA1 એ H2B-HLA-A-HMGA1 સંકુલમાં HLA-A સાથે એકલા H2B અથવા HMGA1 ના બંધનકર્તાની સરખામણીમાં HLA-A સાથે વધુ સારી રીતે બંધનકર્તા દર્શાવ્યું (આકૃતિ 8C,D; કોષ્ટક S5).હાઇડ્રોજન બોન્ડિંગમાં સામેલ અવશેષો (MD મોડલ હાઇ ઓક્યુપન્સી ≥ 10 ns) સંકુલમાં CLMS ઇન્ટરેક્શન સાઇટ્સ (K અથવા S અવશેષો) સાથે સુસંગત છે, જે સૂચવે છે કે CLMS દ્વારા ઓળખવામાં આવેલી ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ ખૂબ જ વિશ્વસનીય છે.વિશ્વસનીયતા (ફિગ. 8E).સીએલએમએસ અને એમડી મોડેલિંગમાં, 190-210 અને લગભગ 200-220 એમિનો એસિડ વચ્ચેના HLA-A અવશેષો અનુક્રમે H2B અને HMGA1 ને બાંધતા જોવા મળ્યા હતા (FIG. 8E).
પ્રોટીન-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ ગતિશીલ માળખાકીય નેટવર્ક બનાવે છે જે ચોક્કસ ઉત્તેજનાના પ્રતિભાવમાં અંતઃકોશિક સંચાર મધ્યસ્થી કરે છે.કારણ કે ઘણા પ્રોટીઓમિક્સ અભિગમો પ્રોટીનના એકંદર સ્થિર રાજ્ય સ્તરમાં ફેરફારોને શોધી કાઢે છે, પ્રોટીન-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયા ગતિશીલતાને બંધનકર્તા ઇન્ટરફેસ મેળવવા માટે વધારાના સાધનોની જરૂર પડે છે, અને CLMS એ આવું એક સાધન છે.ઇન્ટરફેરોન સિગ્નલિંગ સિસ્ટમ એ સાયટોકાઇન નેટવર્ક છે જે કોષોને પર્યાવરણીય રોગકારક અને આંતરિક રોગવિજ્ઞાનવિષયક સંકેતોની શ્રેણીને પ્રતિસાદ આપવા માટે પરવાનગી આપે છે, જે ઇન્ટરફેરોન-ઇન્ડ્યુસિબલ પ્રોટીનના સબસેટના ઇન્ડક્શનમાં પરિણમે છે.ઇન્ટરફેરોન-પ્રેરિત પ્રોટીનની પેનલ વચ્ચે નવલકથા પ્રોટીન-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ ઓળખી શકાય છે કે કેમ તે નિર્ધારિત કરવા માટે અમે CLMS લાગુ કર્યું.ઇન્ટરફેરોન-રિસ્પોન્સિવ ફ્લો-1 સેલ મોડેલમાં વૈશ્વિક પ્રોટીન ક્રોસ-લિંકિંગ વિશ્લેષણનો ઉપયોગ પ્રોટીન સંકુલને મેળવવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.બિન-ક્રોસ-લિંક્ડ અને ક્રોસ-લિંક્ડ કોષોમાંથી ટ્રિપ્ટિક પેપ્ટાઇડ્સનું નિષ્કર્ષણ પેપ્ટાઇડની ગણતરી, પાથવે સંવર્ધન અને વ્યાખ્યાયિત LFQ તીવ્રતા સાથે પેપ્ટાઇડ લંબાઈ વિતરણ માટે પરવાનગી આપે છે.કેનોનિકલ ઇન્ટરફેરોન-ઇન્ડ્યુસિબલ પ્રોટીનને હકારાત્મક આંતરિક નિયંત્રણ તરીકે ઓળખવામાં આવ્યા હતા, જ્યારે કેનોનિકલ ઇન્ટરફેરોન-ઇન્ડ્યુસિબલ પ્રોટીન જેવા કે MX1, UP18, OAS3 અને STAT1ના નવા ઇન્ટરમોલેક્યુલર અને ઇન્ટ્રામોલેક્યુલર ક્રોસ-લિંક્ડ એડક્ટ્સ જોવા મળ્યા હતા.વિવિધ માળખાકીય સુવિધાઓ અને કાર્યાત્મક ક્ષેત્રોમાં ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓની તપાસ કરવામાં આવી છે.
HLA-A, MDN1 અને H2B વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા Flo-1 અને A549 કોશિકાઓમાં ઇમ્યુનોબ્લોટિંગ દ્વારા શોધી કાઢવામાં આવી હતી જે IFNα સાથે સારવાર અને સારવાર ન કરવામાં આવી હતી.અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે IFNα-આશ્રિત રીતે H2B સાથે HLA-A સંકુલ છે.અમારું કાર્ય આ બે સંકુલના સહ-સ્થાનિકીકરણના વધુ સંશોધન માટે એક રસપ્રદ માર્ગ રજૂ કરે છે.સેલ-પ્રકાર-સ્વતંત્ર ઇન્ટરફેરોન-મધ્યસ્થી પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને ઓળખવા માટે સેલ લાઇનના પેનલમાં CLMS અભિગમને વિસ્તૃત કરવું પણ રસપ્રદ રહેશે.અંતે, અમે H2BFS-HLA-A-HMGA1 સંકુલમાં સમાવિષ્ટ પ્રોટીનની રચનાત્મક ગતિશીલતાને સમજવા માટે વૈકલ્પિક અભિગમ તરીકે MD મોડેલિંગનો ઉપયોગ કર્યો, જે ઇન્ટ્રામોલેક્યુલર અને ઇન્ટરમોલેક્યુલર ક્રોસ-ટૉક્સને ટ્રૅક કરે છે.CLMS ડેટાના અનુમાન H2BFS, HLA-A, અને HMGA1 પ્રોટીનની વિવિધ રચનાઓની શક્યતા સૂચવે છે.આ ડોકીંગ પ્રોટીન કોમ્પ્લેક્સ વચ્ચેની સંભવિત વિવિધ રચનાઓએ CLMS ડેટાસેટમાં અવલોકન કરેલ સમાન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ જાહેર કરી.અમારી પદ્ધતિની મુખ્ય શક્તિઓમાંની એક એ છે કે તે HLA જેવા અત્યંત પોલીમોર્ફિક જનીનોની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને સરળ રીતે ઓળખવાની મંજૂરી આપે છે, તેથી HLA હેપ્લોટાઇપ-વિશિષ્ટ પ્રોટીનની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓનો અભ્યાસ કરવો રસપ્રદ રહેશે જેનો અભ્યાસ કરવો અન્યથા મુશ્કેલ છે.એકસાથે લેવામાં આવે તો, અમારો ડેટા દર્શાવે છે કે CLMS નો ઉપયોગ ઇન્ટરફેરોન-પ્રેરિત સિગ્નલિંગ નેટવર્ક્સની અમારી સમજને વિસ્તૃત કરવા અને ટ્યુમર માઇક્રોએનવાયરમેન્ટમાં વધુ જટિલ ઇન્ટરસેલ્યુલર સિસ્ટમ્સનો અભ્યાસ કરવા માટેનો આધાર પૂરો પાડવા માટે થઈ શકે છે.
Flo-1 કોષો ATCC માંથી મેળવવામાં આવ્યા હતા અને DMEM (Gibco) માં 1% પેનિસિલિન/સ્ટ્રેપ્ટોમાસીન (ઈનવિટ્રોજન), 10% ફેટલ બોવાઈન સીરમ (Gibco) સાથે પૂરક અને 37°C અને 5% CO2 પર સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યા હતા.ઇન્ક્યુબેશન.IFNα14 (એડિનબર્ગ પ્રોટીન ઉત્પાદન સુવિધા દ્વારા ઉત્પાદિત) સાથે સારવાર કરવામાં આવે તે પહેલાં કોષો 70-80% સંગમ સુધી ઉગાડવામાં આવ્યા હતા.અન્ય તમામ રસાયણો અને રીએજન્ટ સિગ્મા એલ્ડ્રીચ પાસેથી ખરીદવામાં આવ્યા હતા સિવાય કે અન્યથા નોંધવામાં આવે.
Flo-1 કોષોને 6-વેલ પ્લેટમાં સંવર્ધન કરવામાં આવ્યું હતું અને બીજા દિવસે કોષોને 10 ng/ml IFNα14 સાથે 24 કલાક માટે લગભગ 80% સંગમથી સારવાર આપવામાં આવી હતી.કોષોને પીબીએસ વડે ત્રણ વખત ધોવામાં આવ્યા હતા અને તાજી તૈયાર ડીએસએસ (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) (ડીએમએસઓમાં ઓગળેલા) સાથે પીબીએસમાં 5 મિનિટ માટે 37 ° સે. પર 0.5 એમએમની અંતિમ સાંદ્રતા માટે બંધ કરવામાં આવ્યા હતા.ડીએસએસ ક્રોસલિંકિંગ પ્રતિક્રિયાને પીબીએસ સાથે બદલવામાં આવી હતી અને પીબીએસમાં 37 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર 15 મિનિટ માટે 20 એમએમ ટ્રિસ (પીએચ 8.0) ઉમેરીને શેષ ડીએસએસને શાંત કરવામાં આવ્યો હતો.કોષો સ્ક્રેપિંગ દ્વારા એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા અને ઓછી બંધનકર્તા ટ્યુબ (એક્સિજન) માં એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા.
સેલ પેલેટને 300 µl યુરિયા લિસિસ બફર (8 M યુરિયા, 0.1 M Tris, pH 8.5) સાથે 30 મિનિટ માટે ઓરડાના તાપમાને પ્રસંગોપાત ધ્રુજારી સાથે લિઝ કરવામાં આવી હતી.તમામ સેન્ટ્રીફ્યુગેશન સ્ટેપ્સ 8°C પર 14,000 xg પર કરવામાં આવ્યા હતા.10 મિનિટ માટે લિસેટને સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો અને સુપરનેટન્ટને નવી ટ્યુબમાં સ્થાનાંતરિત કરો.બાકીના સ્પષ્ટ કણોને બીજા લિસિસ બફરના 150 μl (2 M યુરિયા, 2% (w/v) SDS (સોડિયમ ડોડેસીલ સલ્ફેટ)) માં 30 મિનિટ કે તેથી વધુ સમય સુધી એક સમાન જલીય દ્રાવણ પ્રાપ્ત ન થાય ત્યાં સુધી ઓગળવામાં આવ્યા હતા.લાઇસેટને 20 મિનિટ માટે સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું અને સુપરનેટન્ટને અગાઉના પગલામાં મેળવેલા લિસેટ સાથે મિશ્રિત કરવામાં આવ્યું હતું.માઇક્રોપ્લેટ પ્રક્રિયાઓ માટે ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર માઇક્રો BCA એસે (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) નો ઉપયોગ કરીને પ્રોટીન સાંદ્રતાનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું.નમૂનાઓ ઝડપથી પ્રવાહી નાઇટ્રોજનમાં સ્થિર થઈ ગયા હતા અને -80 ° સે પર સંગ્રહિત થયા હતા.
લગભગ 100 μg દ્રાવ્ય ક્રોસ-લિંક્ડ પ્રોટીનને વિસ્નીવસ્કી એટ અલ દ્વારા વર્ણવ્યા મુજબ સુધારેલા ફિલ્ટરેશન સેમ્પલ તૈયારી પ્રોટોકોલ (FASP) નો ઉપયોગ કરીને પ્રક્રિયા કરવામાં આવી હતી.69 સંક્ષિપ્તમાં, પ્રોટીનને 200 μl યુરિયા બફર (0.1 M ટ્રિસમાં 8 M યુરિયા, pH 8.5), વમળ અને અડધું સાથે ક્રોસલિંક કરવામાં આવે છે.તમામ સેન્ટ્રીફ્યુગેશન સ્ટેપ્સ 25°C પર 14,000 xg પર કરવામાં આવ્યા હતા.ક્રોસ-લિંક્ડ પ્રોટીન લાયસેટનો પ્રથમ અર્ધ અલ્ટ્રાસેલ-10 મેમ્બ્રેન (મર્ક) થી સજ્જ 10 kDa માઇક્રોકોન સેન્ટ્રીફ્યુગલ ફિલ્ટર ઉપકરણમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવ્યો હતો, ત્યારબાદ 25 મિનિટ માટે ફિલ્ટર પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન કરવામાં આવ્યું હતું.પછી ફિલ્ટરમાં પ્રોટીનનો બીજો ભાગ ઉમેરો અને તે જ પગલાંઓનું પુનરાવર્તન કરો.પ્રોટીન પુનઃપ્રાપ્તિ યુરિયા બફરમાં 100 μl 17 mM tris(2-carboxyethyl) ફોસ્ફાઇન હાઇડ્રોક્લોરાઇડ (TCEP) ઉમેરીને કરવામાં આવી હતી.પુનઃપ્રાપ્તિ થર્મોમિક્સર પર 600 આરપીએમ પર 30 મિનિટ માટે 37 ° સે પર હલાવવામાં આવી હતી.વધુમાં, સ્તંભને સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું અને યુરિયા બફરમાં 50 એમએમ આયોડોએસેટામાઇડના 100 μlનો ઉપયોગ કરીને ઘટાડેલા ક્રોસ-લિંક્ડ પ્રોટીનને અલ્કાયલેટેડ કરવામાં આવ્યું હતું.આલ્કિલેશન પ્રતિક્રિયા ઓરડાના તાપમાને અંધારામાં 20 મિનિટ માટે હાથ ધરવામાં આવી હતી.સ્તંભને ફેરવો, 100 µl યુરિયા બફર વડે સ્તંભની દિવાલોને 3 વખત ધોઈ લો અને પછી સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો.100 એમએમ એમોનિયમ બાયકાર્બોનેટના 100 μl નો ઉપયોગ કરીને સમાન કામગીરી 3 વખત કરવામાં આવી હતી.ટ્રિપ્સિનાઇઝેશન પહેલાં, કલેક્શન ટ્યુબને નવી સાથે બદલો.ટ્રિપ્સિન બફર (પ્રોમેગા) માં 50 એમએમ એમોનિયમ બાયકાર્બોનેટ અને 1 µl ટ્રિપ્સિન ઓગળેલું પાચન બફર ઉમેરો.ટ્રિપ્સિન અને પ્રોટીનનો ગુણોત્તર લગભગ 1:33 જાળવવામાં આવ્યો હતો, અને પાચન પ્રતિક્રિયાઓ ભેજવાળી ચેમ્બરમાં 37° સે પર રાતોરાત ઉકાળવામાં આવી હતી.ક્રોસલિંક્ડ પેપ્ટાઈડને 25 મિનિટ માટે સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા ફિલ્ટરમાંથી બહાર કાઢવામાં આવ્યું હતું.ફિલ્ટરમાં 0.5 M NaCl ના 50 μl ઉમેરીને પેપ્ટાઇડ પુનઃપ્રાપ્તિમાં સુધારો કરવામાં આવ્યો હતો, ત્યારબાદ 25 મિનિટ માટે સેન્ટ્રીફ્યુગેશન કરવામાં આવ્યું હતું.
C18 માઇક્રો સ્પિન કૉલમ્સ (હાર્વર્ડ એપેરેટસ) નો ઉપયોગ નજીવા ફેરફારો સાથે બોચલ એટ અલ.70 દ્વારા વર્ણવેલ પ્રોટોકોલને અનુસરીને ક્રોસ-લિંક્ડ ટ્રિપ્ટિક પેપ્ટાઇડ્સને ડિસોલ્ટ કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.સંક્ષિપ્તમાં, C18 સ્પિન કૉલમ એસિટોનાઇટ્રાઇલ (AcN) (મર્ક) માં 0.1% ફોર્મિક એસિડ (FA) ના ત્રણ ધોવા અને 0.1% FA ના બે ધોવા સાથે સક્રિય કરવામાં આવ્યા હતા.કૉલમ 15 મિનિટ માટે 0.1% FA સાથે હાઇડ્રેટેડ હતી.સ્પિન કૉલમમાં નમૂનાઓ લોડ કરો અને 0.1% એફએ સાથે 3 વખત ધોવા.0.1% FA માં 50%, 80% અને 100% AcN નો ઉપયોગ કરીને ડીસલ્ટેડ પેપ્ટાઈડ્સને ક્રમશઃ સ્ટેપવાઇઝ ગ્રેડિયન્ટ સાથે ઝીણવટપૂર્વક કાઢવામાં આવી હતી.સેમ્પલને સ્પીડવેક પ્લસ કોન્સેન્ટ્રેટર (એપેન્ડોર્ફ) માં સૂકવવામાં આવ્યા હતા જ્યાં સુધી અવશેષ પ્રવાહી સંપૂર્ણપણે અદૃશ્ય થઈ જાય.એલ્યુટેડ પેપ્ટાઇડ્સ 2.5% AcN માં 0.08% ટ્રાઇફ્લુરોએસેટિક એસિડના 100 μl માં ઓગળવામાં આવ્યા હતા અને સાંદ્રતા નેનોડ્રોપ 2000 (થર્મો સાયન્ટિફિક) પર માપવામાં આવી હતી.નમૂના દીઠ આશરે 1 μg ક્રોસલિંક્ડ પેપ્ટાઇડ LC-MS/MS સિસ્ટમમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યું હતું.
ઓર્બિટ્રેપ એક્સપ્લોરિસ 480 માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર (થર્મો સાયન્ટિફિક) સાથે જોડાયેલ અલ્ટીમેટ 3000 RSLCnano LC સિસ્ટમ (થર્મો સાયન્ટિફિક) પર ક્રોસ-લિંક્ડ પેપ્ટાઈડ્સને અલગ કરવામાં આવ્યા હતા.ક્રોસ-લિંક્ડ પેપ્ટાઇડ્સ 300 µm ID પર એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા, 5 mm લાંબા µ-પ્રી-કૉલમ C18 કૅપ્ચર કૉલમ C18 PepMap100 સોર્બન્ટ અને 5 µm પેપમેપ સોર્બન્ટ (થર્મો સાયન્ટિફિક) સાથે પેક કરવામાં આવ્યા હતા.2.5% AcN માં ઓગળેલા 5 μl/મિનિટ 0.08% ટ્રાઇફ્લુરોએસેટિક એસિડ પર પંપ ફ્લો સેટ લોડ કરો.2 μm પેપમેપ સોર્બેન્ટ (થર્મો સાયન્ટિફિક)થી ભરેલા 75 μm ના આંતરિક વ્યાસ અને 150 mm લંબાઈ સાથે વિશ્લેષણાત્મક ફ્યુઝ્ડ સિલિકા કૉલમ પર ક્રોસ-લિંક્ડ પેપ્ટાઈડ્સ અલગ કરવામાં આવ્યા હતા.મોબાઇલ તબક્કા A અને Bમાં અનુક્રમે પાણીમાં 0.1% FA અને એસિટોનાઇટ્રાઇલમાં 0.1% FAનો સમાવેશ થાય છે.ઢાળ 2.5% B થી શરૂ થાય છે અને 90 મિનિટમાં રેખીય રીતે 40% B સુધી વધે છે, પછી આગામી 2 મિનિટમાં 90% B થાય છે.મોબાઇલ તબક્કાની રચના 10 મિનિટ માટે 90% B પર જાળવવામાં આવી હતી અને પછી 2 મિનિટમાં રેખીય રીતે ઘટીને 2.5% B થઈ ગઈ હતી.આગલા ચક્રની 8 મિનિટ પહેલાં કૉલમ 2.5% B પર સંતુલિત હતી.વિશ્લેષણાત્મક સ્તંભમાંથી બહાર કાઢવામાં આવેલા ક્રોસ-લિંક્ડ પેપ્ટાઈડ્સ નેનોઈલેક્ટ્રોસ્પ્રે આયનાઈઝેશન (NSI) સ્ત્રોતમાં આયનીકરણ કરવામાં આવ્યા હતા અને એક્સપ્લોરિસ 480 માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર (થર્મો સાયન્ટિફિક) માં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા.
ઓર્બિટ્રેપ એક્સપ્લોરિસ 480 માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર હકારાત્મક ડેટા કોરિલેશન મોડમાં કાર્યરત છે.m/z 350 Th થી m/z 2000 Th રેન્જ સેટિંગ્સ સાથે 120,000 ના રિઝોલ્યુશન પર વિભાગ મોડમાં સંપૂર્ણ સ્કેન કરવામાં આવ્યું હતું.સામાન્યકૃત AGC લક્ષ્ય 300% પર 50ms ના મહત્તમ ઇનપુટ સમય સાથે સેટ કરવામાં આવ્યું હતું.પેપ્ટાઇડ્સ માટે મોનોઇસોટોપિક પીક ડિટેક્શનની સ્થાપના કરવામાં આવી છે.જો બહુ ઓછા પુરોગામી મળ્યા હોય તો અવરોધ છૂટછાટ પરિમાણ સાચું પર સેટ કરવામાં આવે છે.પુરોગામીની લઘુત્તમ આયનીય શક્તિ 5.0e3 પર સેટ કરવામાં આવી હતી અને +8 સુધીની પૂર્વવર્તી ચાર્જ સ્થિતિ પ્રયોગોમાં સામેલ કરવામાં આવી હતી.
ડેટા કોરિલેશન મોડમાં મુખ્ય સ્કેન વચ્ચેનો ચક્ર સમય 2.5 સેકન્ડ પર સેટ કરવામાં આવ્યો હતો.પૂર્વવર્તી આયનના પ્રથમ વિભાજન પછી ગતિશીલ સમૂહ બાકાત 20 સે પર સેટ કરવામાં આવ્યું હતું.પૂર્વવર્તી આઇસોલેશન વિન્ડો 2 મી પર સેટ કરવામાં આવી હતી.સ્થિર અથડામણ ઊર્જા મોડ સાથે સામાન્યકૃત અથડામણ ઊર્જાનો પ્રકાર ડેટા આધારિત MS/MS સ્કેનમાં પસંદ કરવામાં આવ્યો હતો.અથડામણ ઊર્જા 30% પર સેટ.ઓર્બિટ્રેપ રિઝોલ્યુશન 15,000 અને AGC લક્ષ્ય 100% પર સેટ કરવામાં આવ્યું હતું.કસ્ટમ મહત્તમ ઈન્જેક્શન સમય 60 મિલીસેકન્ડ પર સેટ કરેલ છે.
ક્રોસ-લિંક્ડ નમૂનાઓમાં પ્રોટીન-પ્રોટીન નેટવર્કને ટ્રેક કરતા પહેલા, અમે નમૂનાઓમાં શોધી શકાય તેવા પેપ્ટાઇડ્સ/પ્રોટીનને ઓળખવા માટે MaxQuant પેકેજ (સંસ્કરણ 1.6.12.0)26,27 નો ઉપયોગ કરીને કાચી ફાઇલોની પ્રક્રિયા કરી.વધુમાં, IFNα સાથે સારવાર અને સારવાર ન કરાયેલ અનક્રોસલિંક્ડ Flo-1 નમૂનાઓ પર સમાન પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યા હતા.બિલ્ટ-ઇન સર્ચ એન્જીન એન્ડ્રોમેડા27 નો ઉપયોગ કરીને યુનિપ્રોટ માનવ ડેટાબેઝ (www.uniprot.org) (12 ઓગસ્ટ, 2020 ના રોજ અપલોડ કરાયેલ, 75,093 એન્ટ્રીઓ ધરાવે છે) માં MS/MS ડેટા શોધવામાં આવ્યો હતો.એન્ઝાઇમની વિશિષ્ટતા અને ડેમિડેશન (N, Q) અને ઓક્સિડેશન (M) ના વિવિધ ફેરફારો સૂચવ્યા વિના શોધ હાથ ધરવામાં આવી હતી.પૂર્વવર્તી સમૂહ સહિષ્ણુતા 20 પીપીએમ અને ઉત્પાદન આયન 0.02 Da પર સેટ કરવામાં આવી હતી.પ્રારંભિક અને મહત્તમ સમૂહ વિચલન 10 પીપીએમ પર સેટ કરવામાં આવ્યું હતું.પેપ્ટાઈડનો મહત્તમ સમૂહ 4600 Da પર સેટ કરવામાં આવ્યો હતો અને ક્રમ સમાનતા 7 અને 25 એમિનો એસિડ (aa) વચ્ચે સેટ કરવામાં આવી હતી.પર્સિયસ પ્રોગ્રામ (સંસ્કરણ 1.6.10.45) નો ઉપયોગ કરીને વધુ આંકડાકીય વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.પ્રોટીન સામગ્રીની ગણતરી પ્રોટીનની સ્પેક્ટ્રલ તીવ્રતાને સામાન્ય કરીને કરવામાં આવી હતી (LFQ તીવ્રતા; લેબલ વગરનું પ્રમાણીકરણ)27 અને તીવ્રતાના મૂલ્યોને Log2 માં રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યા હતા.R (v 4.1.2) માં ફીટમેપ (v1.0.12) પેકેજનો ઉપયોગ કરીને તેમની પેપ્ટાઇડની તીવ્રતા દ્વારા ઓળખાયેલ પ્રોટીનનું અધિક્રમિક ક્લસ્ટરિંગ બનાવવામાં આવ્યું હતું.પાથવે સંવર્ધન વિશ્લેષણ IFNα-સારવાર કરાયેલ પ્રોટીન માટે રિએક્ટોમ પાથવે ડેટાબેઝનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું જે સારવાર ન કરાયેલ નમૂનાઓની તુલનામાં ચાર ગણાથી વધુ સક્રિય હતા.
LC-MS/MS દ્વારા મોનિટર કરાયેલા પ્રોટીન કોમ્પ્લેક્સના લાયસિન (K) અથવા સેરીન (S) વિશિષ્ટ રાસાયણિક ક્રોસલિંક્સની ઓળખ ક્રોસ-લિંક્ડ પેપ્ટાઇડ્સ (SIM-XL)29 માટે સ્પેક્ટ્રોસ્કોપિક આઇડેન્ટિફિકેશન મશીન (SIM-XL) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી.પ્રથમ, પાદરીયા એટ અલ.28 માં વર્ણવેલ IRDS પ્રોટીન ડેટાસેટનો ઉપયોગ કરીને ઇન્ટરફેરોન-સંબંધિત (IFN) DNA ડેમેજ રેઝિસ્ટન્સ સિગ્નેચર (IRDS) જનીનો વચ્ચેની સંભવિત ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓની તપાસ કરવામાં આવી હતી.સમગ્ર માનવ યુનિપ્રોટની તમામ સ્થિતિઓ અને પુનરાવર્તિતતાઓનું સ્ક્રિનિંગ કોમ્પ્યુટેશનલી સઘન છે, તેથી સમગ્ર માનવ યુનિપ્રોટ ડેટાબેઝ (www.uniprot.org) (12 ઓગસ્ટ 2020 ના રોજ ડાઉનલોડ કરેલ, 75,093 એન્ટ્રીઓ ધરાવે છે) IFNα- સારવાર કરેલ પુનરાવર્તનો સામે.ઉચ્ચ વિશ્વાસની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ માટેનું એક ફિલ્ટર.પ્રાપ્ત કરેલ આ ઉચ્ચ-મહત્વપૂર્ણ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ તમામ પુનરાવર્તનો અને પરિસ્થિતિઓમાં વિસ્તૃત અને પરીક્ષણ કરવામાં આવી હતી.
SIM-XL માં, DSS નો ઉપયોગ ક્રોસલિંકર (XL) માટે કરવામાં આવ્યો હતો અને XL વેઈટ શિફ્ટ અને મોડિફિકેશન વેઈટ શિફ્ટ અનુક્રમે 138.06 અને 156.07 પર સેટ કરવામાં આવી હતી.નીચેની ક્રોસલિંકિંગ પ્રતિક્રિયા સાઇટ્સ ગણવામાં આવે છે: KK, KS અને KN-TERM, રિપોર્ટર આયનો વિના.પુરોગામી અને ફ્રેગમેન્ટ પીપીએમ બંને 20 અને Xrea થ્રેશોલ્ડ 0.15 પર સેટ કરવામાં આવ્યા હતા.ટ્રિપ્સિનને સંપૂર્ણપણે વિશિષ્ટ માનવામાં આવતું હતું, અને ઉચ્ચ-ઊર્જા સી-ટ્રેપ (HCD) ફ્રેગમેન્ટેશન પદ્ધતિ લાગુ કરવામાં આવી હતી.XCorr ડાયનેમિક DB રિડક્શન થ્રેશોલ્ડ અને ડાયનેમિક DB રિડક્શન માટે પેપ્ટાઇડ્સની ન્યૂનતમ સંખ્યા અનુક્રમે 2.5 અને 2 પર સેટ કરવામાં આવી હતી.અન્ય પરિમાણો છે: મોનોસોટોપ સંભવિતતા અને પીક સંયોગ કટઓફ, સ્ટ્રાન્ડ દીઠ ન્યૂનતમ 4 AA અવશેષો અને મહત્તમ સ્ટ્રાન્ડ ચાર્જ, અને ચૂકી ગયેલા વિભાજનના 3 મેક્સિમા.પરિણામી ટાંકાવાળા 2D નકશાનું (SIM-XL)માં વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું અને xQuest28 ગ્રાફિકલ રજૂઆતનો ઉપયોગ 2D નકશા બનાવવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.પ્રોટીન સ્ટ્રક્ચર્સ પર પ્રોટીન ક્રોસલિંક PyMol (PyMOL મોલેક્યુલર ગ્રાફિક્સ સિસ્ટમ, વર્ઝન 2.0 Schrödinger, LLC) માં પ્રદાન કરવામાં આવે છે.
પ્રોટીન મોડેલ સ્ટ્રક્ચર્સ Phyre2 સર્વર (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 નો ઉપયોગ કરીને હોમોલોજી મોડેલિંગ અને "હિડન માર્કોવ મેથડ" ના અમલીકરણના સિદ્ધાંતોનો ઉપયોગ કરીને બનાવવામાં આવ્યા હતા.Phyre2 જાણીતી પ્રોટીન રચનાઓ સાથે અનુક્રમ સંરેખણ પર આધારિત મોડેલ સ્ટ્રક્ચર્સ બનાવે છે.H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, અને MDN1 પ્રોટીન માટે, ટેમ્પલેટ સ્ટ્રક્ચર્સ 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, અને 6i2665 નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.આ ઉપરાંત, AlphaFold71 MX1, UBP18 અને ROBO1 ની રચના પણ ધ્યાનમાં લેવામાં આવી હતી.BIOVIA ડિસ્કવરી સ્ટુડિયો વિઝ્યુઅલાઈઝર પેકેજ (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) અને મોલેક્યુલર ઓપરેટિંગ એન્વાયરમેન્ટ પેકેજ (MOE; કેમિકલ કમ્પ્યુટિંગ ગ્રુપ ઈન્ક., મોન્ટ્રીયલ, ક્વિબેક, કેનેડા) નો ઉપયોગ કરીને પ્રોટીન માળખું વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવામાં આવ્યું હતું.