347 12.7*1.24mm સ્ટેનલેસ સ્ટીલ કોઇલ્ડ ટ્યુબિંગ, સિંક્રનસ ઇલેકટ્રોસ્ટેટિક કન્ડેન્સેશનની મોલેક્યુલર મિકેનિઝમ અને α-સિન્યુક્લિન અને ટાઉનું એકત્રીકરણ

Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર.તમે મર્યાદિત CSS સપોર્ટ સાથે બ્રાઉઝર સંસ્કરણનો ઉપયોગ કરી રહ્યાં છો.શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે અપડેટ કરેલ બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરો (અથવા Internet Explorer માં સુસંગતતા મોડને અક્ષમ કરો).વધુમાં, ચાલુ સમર્થનની ખાતરી કરવા માટે, અમે શૈલીઓ અને JavaScript વિના સાઇટ બતાવીએ છીએ.
સ્લાઇડર્સ સ્લાઇડ દીઠ ત્રણ લેખો દર્શાવે છે.સ્લાઇડ્સમાંથી આગળ વધવા માટે પાછળના અને આગળના બટનોનો ઉપયોગ કરો અથવા દરેક સ્લાઇડમાંથી આગળ વધવા માટે અંતે સ્લાઇડ કંટ્રોલર બટનોનો ઉપયોગ કરો.

347 સ્ટેનલેસ સ્ટીલ પાઇપ સ્પષ્ટીકરણ

347 12.7*1.24mm સ્ટેનલેસ સ્ટીલ કોઇલ્ડ ટ્યુબિંગ

બહારનો વ્યાસ: 6.00 mm OD 914.4 mm OD સુધી, 24” NB સુધીની સાઇઝ એક્સ-સ્ટોક ઉપલબ્ધ છે, OD સાઇઝ સ્ટીલ ટ્યુબ એક્સ-સ્ટોક ઉપલબ્ધ છે

SS 347 પાઇપની જાડાઈ રેન્જ: 0.3mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, વગેરે. (0.5-12mm) અથવા બિન-નિયમિત કદ જરૂરિયાત મુજબ તૈયાર કરવા માટે

પ્રકાર: SS 347 સીમલેસ પાઇપ્સ |SS 347 ERW પાઇપ્સ |SS 347 વેલ્ડેડ પાઈપ્સ |SS 347 ફેબ્રિકેટેડ પાઇપ્સ |SS 347 CDW ટ્યુબ્સ, LSAW પાઇપ્સ / સીમ-વેલ્ડેડ / ફરીથી દોરેલા

ફોર્મ: SS 347 રાઉન્ડ પાઇપ્સ/ ટ્યુબ્સ, SS 347 સ્ક્વેર પાઇપ્સ/ ટ્યુબ્સ, SS 347 લંબચોરસ પાઇપ/ ટ્યુબ્સ, SS 347 કોઇલ્ડ ટ્યુબ્સ, SS 347 “U” શેપ, SS 347 પાન કેક કોઇલ, SS 347 હાઇડ્રેજ

લંબાઈ: સિંગલ રેન્ડમ, ડબલ રેન્ડમ અને જરૂરી લંબાઈનો અંત: સાદો છેડો, બેવલ્ડ એન્ડ, ટ્રેડેડ

એન્ડ પ્રોટેક્શન: પ્લાસ્ટિક કેપ્સ |આઉટસાઇડ ફિનિશ: 2B, No.4, No.1, No.8 સ્ટેનલેસ સ્ટીલ પાઈપો માટે મિરર ફિનિશ, ગ્રાહકની જરૂરીયાત મુજબ સમાપ્ત

ડિલિવરી શરત: એન્નીલ્ડ અને અથાણું, પોલીશ્ડ, બ્રાઈટ એન્નીલ્ડ, કોલ્ડ ડ્રોન

ઇન્સ્પેક્શન, ટેસ્ટ રિપોર્ટ્સ: મિલ ટેસ્ટ સર્ટિફિકેટ્સ, EN 10204 3.1, કેમિકલ રિપોર્ટ્સ, મિકેનિકલ રિપોર્ટ્સ, PMI ટેસ્ટ રિપોર્ટ્સ, વિઝ્યુઅલ ઈન્સ્પેક્શન રિપોર્ટ્સ, થર્ડ પાર્ટી ઈન્સ્પેક્શન રિપોર્ટ્સ, NABL મંજૂર લેબ રિપોર્ટ્સ, ડિસ્ટ્રક્ટિવ ટેસ્ટ રિપોર્ટ, નોન ડિસ્ટ્રક્ટિવ ટેસ્ટ રિપોર્ટ્સ

પેકિંગ: લાકડાના બોક્સ, પ્લાસ્ટિક બેગ, સ્ટીલ સ્ટ્રિપ્સ બંડલ અથવા ગ્રાહકોની વિનંતીઓ અનુસાર પેક

વિશેષ: ઉપરોક્ત સિવાયના કદ અને વિશિષ્ટતાઓ વિનંતી પર ઉત્પાદિત કરી શકાય છે

SS 347 પાઇપ સાઇઝ રેન્જ: 1/2 ઇંચ NB, OD થી 24 ઇંચ

ASTM A312 347: સીમલેસ અને સ્ટ્રેટ-સીમ વેલ્ડેડ ઓસ્ટેનિટીક પાઈપ ઉચ્ચ તાપમાન અને સામાન્ય ક્ષતિગ્રસ્ત સેવા માટે બનાવાયેલ છે.વેલ્ડીંગ દરમિયાન ફિલર મેટલની પરવાનગી નથી.

ASTM A358 347: ક્ષતિગ્રસ્ત અને/અથવા ઉચ્ચ તાપમાન સેવા માટે ઇલેક્ટ્રિક ફ્યુઝન વેલ્ડેડ ઓસ્ટેનિટિક પાઇપ.આ સ્પષ્ટીકરણ માટે સામાન્ય રીતે માત્ર 8 ઇંચ સુધીની પાઇપ બનાવવામાં આવે છે.વેલ્ડીંગ દરમિયાન ફિલર મેટલ ઉમેરવાની મંજૂરી છે.

ASTM A790 347: સીમલેસ અને સ્ટ્રેટ-સીમ વેલ્ડેડ ફેરીટીક/ઓસ્ટેનિટીક (ડુપ્લેક્સ) પાઇપ સામાન્ય કાટરોધક સેવા માટે બનાવાયેલ છે, જેમાં તાણના કાટ ક્રેકીંગના પ્રતિકાર પર ખાસ ભાર મૂકવામાં આવે છે.

ASTM A409 347: સ્ટ્રેટ-સીમ અથવા સર્પાકાર-સીમ ઇલેક્ટ્રિક ફ્યુઝન વેલ્ડેડ મોટા વ્યાસની ઓસ્ટેનિટિક લાઇટ-વોલ પાઇપ 14” થી 30” સાઇઝમાં દિવાલો Sch5S અને Sch 10S સાથે કાટ લાગવા માટે અને/અથવા ઉચ્ચ

ASTM A376 347: ઉચ્ચ તાપમાનના ઉપયોગ માટે સીમલેસ ઓસ્ટેનિટિક પાઇપ.

ASTM A813 347: ઉચ્ચ તાપમાન અને સામાન્ય ક્ષતિગ્રસ્ત એપ્લિકેશન માટે સિંગલ-સીમ, સિંગલ- અથવા ડબલ-વેલ્ડેડ ઓસ્ટેનિટિક પાઇપ.

ASTM A814 347: ઉચ્ચ તાપમાન અને સામાન્ય ક્ષતિગ્રસ્ત સેવા માટે કોલ્ડ-વર્ક્ડ વેલ્ડેડ ઓસ્ટેનિટિક પાઇપ.

347H સ્ટેનલેસ સ્ટીલ પાઇપ્સ કેમિકલ કમ્પોઝિશન

સ્ટેનલેસ સ્ટીલ 347H પાઇપ યાંત્રિક ગુણધર્મો

સ્ટેનલેસ સ્ટીલ 347H પાઇપ્સ ભૌતિક ગુણધર્મો

347H સ્ટેનલેસ સ્ટીલ પાઇપ માટે સમકક્ષ ગ્રેડ

એમીલોઇડ આલ્ફા-સિનુક્લીન (αS) એકત્રીકરણ એ પાર્કિન્સન રોગ અને અન્ય સિન્યુક્લીનોપેથીની ઓળખ છે.તાજેતરમાં, સામાન્ય રીતે અલ્ઝાઈમર રોગ સાથે સંકળાયેલ ટાઉ પ્રોટીન αS પેથોલોજી સાથે સંકળાયેલું છે અને αS-સમૃદ્ધ સમાવેશમાં સહ-સ્થાનિકીકરણ જોવા મળે છે, જોકે બે પ્રોટીનના એકત્રીકરણની પરમાણુ પદ્ધતિ અસ્પષ્ટ રહે છે.અમે અહીં જાણ કરીએ છીએ કે αS તબક્કો ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક જટિલ ઘનીકરણ દ્વારા પ્રવાહી ઘનીકરણમાં વિભાજિત થાય છે જેમ કે ટાઉ જેવા હકારાત્મક ચાર્જ પોલિપેપ્ટાઇડ્સ સાથે.પોલિકેશન્સ માટે αS ની આકર્ષણ અને કોગ્યુલેશન નેટવર્કના સંયોજક અવક્ષયના દર પર આધાર રાખીને, ગંઠાવાનું ધીમી એમીલોઇડ એકત્રીકરણ દ્વારા અનુસરવામાં આવે છે તે ઝડપથી જલીકરણ અથવા સંકલન થાય છે.અદ્યતન બાયોફિઝિકલ તકનીકોના સમૂહને સંયોજિત કરીને, અમે પ્રવાહી-પ્રવાહી αS/Tau તબક્કાના વિભાજનને લાક્ષણિકતા આપવા અને પ્રવાહી પ્રોટીન કન્ડેન્સેટમાં બંને પ્રોટીન ધરાવતા વિજાતીય એકંદરની રચના તરફ દોરી જતા મુખ્ય પરિબળોને ઓળખવામાં સક્ષમ હતા.
મેમ્બ્રેન કમ્પાર્ટમેન્ટ્સ ઉપરાંત, કોશિકાઓમાં અવકાશી વિભાજન પ્રોટીન-સમૃદ્ધ, પ્રવાહી જેવા ગાઢ શરીરની રચના દ્વારા પણ પ્રાપ્ત કરી શકાય છે જેને બાયોમોલેક્યુલર કન્ડેન્સેટ અથવા ટીપું કહેવાય છે, જે લિક્વિડ-લિક્વિડ ફેઝ સેપરેશન (LLPS) તરીકે ઓળખાતી પ્રક્રિયા દ્વારા પ્રાપ્ત થાય છે.આ ટીપું મલ્ટિવેલેન્ટ ટેમ્પોરલ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ દ્વારા રચાય છે, સામાન્ય રીતે પ્રોટીન અથવા પ્રોટીન અને આરએનએ વચ્ચે, અને લગભગ તમામ જીવંત પ્રણાલીઓમાં વિવિધ કાર્યો કરે છે.મોટી સંખ્યામાં એલએલપી-સક્ષમ પ્રોટીન નીચી જટિલતાના ક્રમ દર્શાવે છે જે પ્રકૃતિમાં અને બાયોમોલેક્યુલર કન્ડેન્સેટ 3,4,5ની રચનામાં ખૂબ જ અવ્યવસ્થિત છે.અસંખ્ય પ્રાયોગિક અભ્યાસોએ પ્રોટીનની લવચીક, ઘણીવાર અવ્યવસ્થિત અને બહુસંયોજક પ્રકૃતિ જાહેર કરી છે જે આ પ્રવાહી જેવા ઘનીકરણને બનાવે છે, જો કે આ ઘનીકરણની વૃદ્ધિ અને પરિપક્વતાને નિયંત્રિત કરતા ચોક્કસ પરમાણુ નિર્ધારકો વિશે બહુ ઓછું જાણીતું છે. રાજ્ય.
નવો ડેટા એ પૂર્વધારણાને સમર્થન આપે છે કે અપ્રિય પ્રોટીન-સંચાલિત LLPS અને ટીપાંનું ઘન બંધારણમાં રૂપાંતર એ સંબંધિત સેલ્યુલર માર્ગો હોઈ શકે છે જે અદ્રાવ્ય ઝેરી એકત્રીકરણની રચના તરફ દોરી જાય છે જે ઘણીવાર ડીજનરેટિવ રોગોની લાક્ષણિકતા છે.ઘણા LLPS-સંબંધિત આંતરિક રીતે અવ્યવસ્થિત પ્રોટીન (IDPs), જે ઘણીવાર ખૂબ ચાર્જ અને લવચીક હોય છે, લાંબા સમયથી એમીલોઇડ એકત્રીકરણની પ્રક્રિયા દ્વારા ન્યુરોડિજનરેશન સાથે સંકળાયેલા છે.ખાસ કરીને, બાયોમોલેક્યુલર IDP કન્ડેન્સેટ જેમ કે FUS7 અથવા TDP-438 અથવા hnRNPA19 જેવા મોટા નીચા જટિલતાવાળા ડોમેન્સ ધરાવતા પ્રોટીનને પ્રવાહીકરણ નામની પ્રક્રિયા દ્વારા જેલ જેવા અથવા ઘન સ્વરૂપમાં પણ વયમાં દર્શાવવામાં આવ્યું છે.સંયોજનસોલિડ ફેઝ ટ્રાન્ઝિશન (LSPT) માટે સમયના કાર્ય તરીકે અથવા અમુક પોસ્ટ-ટ્રાન્સલેશનલ ફેરફારો અથવા પેથોલોજીકલ રીતે નોંધપાત્ર પરિવર્તનના પ્રતિભાવમાં 1,7.
વિવોમાં LLPS સાથે સંકળાયેલ અન્ય IDP ટાઉ છે, જે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ-સંબંધિત અવ્યવસ્થિત પ્રોટીન છે જેનું એમાયલોઇડ એકત્રીકરણ અલ્ઝાઇમર રોગમાં સામેલ છે10 પણ તાજેતરમાં પાર્કિન્સન રોગ (PD) અને અન્ય સિનેપ્ટિક ન્યુક્લિયર પ્રોટીનોપેથી 11, 12, 13 સંબંધિત છે.અનુકૂળ ઈલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને કારણે ટાઉ સ્વયંભૂ રીતે સોલ્યુશન/સાયટોપ્લાઝમથી અલગ થઈ જતા દર્શાવવામાં આવ્યું છે, જેના પરિણામે ઈલેક્ટ્રોસ્ટેટિક કોસરવેટ્સ તરીકે ઓળખાતા ટાઉ-સમૃદ્ધ ટીપાઓનું નિર્માણ થાય છે.એવું પણ જોવામાં આવ્યું છે કે આ પ્રકારની બિન-વિશિષ્ટ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા પ્રકૃતિમાં ઘણા બાયોમોલેક્યુલર કન્ડેન્સેટ પાછળ ચાલક બળ છે15.ટાઉ પ્રોટીનના કિસ્સામાં, ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક એકત્રીકરણ સરળ એકત્રીકરણ દ્વારા રચી શકાય છે, જેમાં પ્રોટીનના વિપરીત ચાર્જવાળા વિસ્તારો ક્લીવેજ પ્રક્રિયાને ઉત્તેજિત કરે છે, અથવા આરએનએ જેવા નકારાત્મક ચાર્જ પોલિમર સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા દ્વારા જટિલ એકત્રીકરણ દ્વારા.
તાજેતરમાં, α-synuclein (αS), PD અને અન્ય ન્યુરોડીજનરેટિવ રોગોમાં સામેલ એમાયલોઇડ IDP, જે સામૂહિક રીતે સિન્યુક્લીનોપેથી17,18 તરીકે ઓળખાય છે, સેલ્યુલર અને પ્રાણીઓના મોડલમાં 19,20 પ્રોટીન કન્ડેન્સેટમાં કેન્દ્રિત પ્રવાહી જેવા વર્તનમાં દર્શાવવામાં આવ્યું છે.ઇન વિટ્રો અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે αS મુખ્યત્વે હાઇડ્રોફોબિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ દ્વારા સરળ એકત્રીકરણ દ્વારા LLPSમાંથી પસાર થાય છે, જો કે આ પ્રક્રિયામાં અપવાદરૂપે ઉચ્ચ પ્રોટીન સાંદ્રતા અને સામાન્ય રીતે લાંબા સેવન સમય 19,21 જરૂરી છે.વિવોમાં જોવામાં આવેલ αS-સમાવતી કન્ડેન્સેટ આ અથવા અન્ય LLPS પ્રક્રિયાઓ દ્વારા રચાય છે કે કેમ તે મુખ્ય વણઉકેલાયેલ મુદ્દો છે.તેવી જ રીતે, જોકે PD અને અન્ય સિન્યુક્લિનોપેથીમાં ચેતાકોષોમાં αS એમીલોઇડ એકત્રીકરણ જોવા મળ્યું છે, ચોક્કસ પદ્ધતિ કે જેના દ્વારા αS અંતઃકોશિક એમાયલોઇડ એકત્રીકરણમાંથી પસાર થાય છે તે અસ્પષ્ટ રહે છે, કારણ કે આ પ્રોટીનની વધુ પડતી અભિવ્યક્તિ આ પ્રક્રિયાને જાતે જ ટ્રિગર કરતી દેખાતી નથી.વધારાના સેલ્યુલર નુકસાનની ઘણીવાર આવશ્યકતા હોય છે, જે સૂચવે છે કે અંતઃકોશિક αS એમીલોઇડ એસેમ્બલીઝના પુનઃનિર્માણ માટે અમુક સેલ્યુલર સ્થાનો અથવા સૂક્ષ્મ વાતાવરણ જરૂરી છે.એક સેલ્યુલર વાતાવરણ જે ખાસ કરીને એકત્રીકરણ માટે સંવેદનશીલ હોય છે તે પ્રોટીન કન્ડેન્સેટ 23 નું આંતરિક ભાગ હોઈ શકે છે.
રસપ્રદ વાત એ છે કે, αS અને tau એ પાર્કિન્સન રોગ અને અન્ય સિન્યુક્લીનોપેથીઓ 24,25 સાથે મનુષ્યોમાં લાક્ષણિક રોગના સમાવેશમાં સહ-સ્થાનિક હોવાનું જણાયું છે અને પ્રયોગોએ બે પ્રોટીન 26,27 વચ્ચે સિનર્જિસ્ટિક પેથોલોજીકલ સંબંધ દર્શાવ્યો છે જે એકત્રીકરણ αS અને વચ્ચે સંભવિત સંબંધ સૂચવે છે. ન્યુરોડિજનરેટિવ રોગોમાં ટાઉ.બીમારી.વિટ્રો અને વિવો 28,29 માં αS અને tau એકબીજાના એકત્રીકરણને સંચાર કરે છે અને પ્રોત્સાહન આપે છે અને આ બે પ્રોટીનથી બનેલા વિજાતીય એકત્રીકરણ સિન્યુક્લિનોપેથી 30 ધરાવતા દર્દીઓના મગજમાં જોવા મળ્યા છે.જો કે, αS અને tau વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાના પરમાણુ આધાર અને તેના સહ-એકત્રીકરણની પદ્ધતિ વિશે થોડું જાણીતું છે.αS એ αS ના અત્યંત નકારાત્મક રીતે ચાર્જ કરેલ C-ટર્મિનલ પ્રદેશ અને તાઉના કેન્દ્રીય પ્રોલાઇન-સમૃદ્ધ પ્રદેશ વચ્ચે ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક આકર્ષણ દ્વારા ટાઉ સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરી હોવાનું નોંધાયું છે, જે હકારાત્મક રીતે ચાર્જ થયેલા અવશેષોમાં પણ સમૃદ્ધ છે.
આ અધ્યયનમાં, અમે બતાવીએ છીએ કે αS ખરેખર ટાઉ પ્રોટીનની હાજરીમાં ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક જટિલ ઘનીકરણ દ્વારા ટીપાંમાં વિચ્છેદ કરી શકે છે, અન્ય હકારાત્મક ચાર્જ પોલિપેપ્ટાઇડ્સ જેમ કે પોલી-એલ-લાયસિન (pLK) સાથે તેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાથી વિપરીત અને આ પ્રક્રિયામાં.αS ટીપું નેટવર્ક માટે સ્કેફોલ્ડ પરમાણુ તરીકે કામ કરે છે.અમે ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક αS કોસેર્વેટ્સની પરિપક્વતાની પ્રક્રિયામાં નોંધપાત્ર તફાવતો ઓળખ્યા છે, જે કોસેર્વેટ નેટવર્કમાં સામેલ પ્રોટીનની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાની વેલેન્સી અને તાકાતમાં તફાવત સાથે સંકળાયેલા છે.રસપ્રદ વાત એ છે કે, અમે લાંબા સમય સુધી જીવતા પ્રવાહી કોસર્વેટ્સમાં αS અને tau amyloid પ્રોટીનના સહ-એગ્રિગેશનનું અવલોકન કર્યું અને કેટલાક મુખ્ય પરિબળોને ઓળખ્યા જે આવા કોસર્વેટ્સમાં આ બે પ્રોટીનના સહ-એકત્રીકરણ તરફ દોરી જાય છે.અહીં અમે આ પ્રક્રિયાનું વિગતવાર વર્ણન કરીએ છીએ, જે રોગ-વિશિષ્ટ સમાવેશમાં બે પ્રોટીનના સ્થાનિકીકરણ અંતર્ગત સંભવિત પરમાણુ પદ્ધતિ છે.
αS પાસે તટસ્થ pH (ફિગ. 1a) પર અત્યંત એનિઓનિક સી-ટર્મિનલ પૂંછડી છે, અને અમે અનુમાન કર્યું છે કે તે પોલિકેશનિક અવ્યવસ્થિત પોલિપેપ્ટાઇડ પરમાણુઓ સાથે ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક સંકુલના ઘનીકરણ દ્વારા LLPSમાંથી પસાર થઈ શકે છે.ન્યુટ્રલ pH 32 પર તેના સકારાત્મક ચાર્જ અને અવ્યવસ્થિત પોલિમેરિક પ્રકૃતિને કારણે અમે પ્રારંભિક મોડલ પરમાણુ તરીકે 100-અવશેષ પોલી-એલ-લાયસિન (pLK) નો ઉપયોગ કર્યો. પ્રથમ, અમે પુષ્ટિ કરી કે pLK સોલ્યુશન NMR સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી દ્વારા αS ના Ct ડોમેન સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે. (આકૃતિ 1b) વધતા αS:pLK દાઢ ગુણોત્તરની હાજરીમાં 13C/15N-લેબલવાળા αS નો ઉપયોગ.αS ના Ct-ડોમેન સાથે pLK ની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા રાસાયણિક પાળીના વિક્ષેપમાં અને પ્રોટીનના આ પ્રદેશમાં ટોચની તીવ્રતામાં ઘટાડો દર્શાવે છે.રસપ્રદ વાત એ છે કે, જ્યારે આપણે pLK સાથે αS ને લગભગ αS સાંદ્રતામાં મિશ્રિત કરીએ છીએ.પોલિઇથિલિન ગ્લાયકોલ (5–15% PEG-8) ની હાજરીમાં 5–25 µM (સામાન્ય LLPS બફર: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) અમે તરત જ પ્રોટીન રચનાના વિશાળ ક્ષેત્રમાંથી પસાર થયા. .ફ્લોરોસેન્સ (WF) અને બ્રાઇટ-ફીલ્ડ (BF) માઇક્રોસ્કોપી (ફિગ. 1c) નો ઉપયોગ કરીને ટીપું જોવામાં આવ્યું હતું.1-5 µm ટીપું જેમાં કેન્દ્રિત αS (ઉમેરાયેલ 1 µM AlexaFluor488-લેબલ αS, AF488-αS), તેમના ઈલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ગુણધર્મો તેમના 10% 1,6-હેક્સનેડિઓલ (1,6-HD) અને તેની સંવેદના પ્રત્યેના પ્રતિકારથી મેળવી શકાય છે. NaCl સાંદ્રતામાં વધારો (ફિગ. 1c).αS/pLK ઈલેક્ટ્રોસ્ટેટિક કોમ્પ્લેક્સના કોસર્વેટ્સની પ્રવાહી જેવી પ્રકૃતિ મિલિસેકન્ડમાં ફ્યુઝ કરવાની તેમની ક્ષમતા દ્વારા દર્શાવવામાં આવે છે (ફિગ. 1d).ટર્બિડીમેટ્રીનો ઉપયોગ કરીને, અમે આ શરતો હેઠળ ટીપાંની રચનાનું પ્રમાણ નક્કી કર્યું, તેની સ્થિરતા (ફિગ. 1e) સાથે સંકળાયેલ મુખ્ય ક્રિયાપ્રતિક્રિયાની ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક પ્રકૃતિની પુષ્ટિ કરી, અને LLPS પ્રક્રિયા (ફિગ. 1f) પર વિવિધ પોલિમર રેશિયોની અસરનું મૂલ્યાંકન કર્યું.પોલિમર રેશિયોની વિશાળ શ્રેણીમાં ટીપું રચના જોવા મળે છે, જ્યારે pLK αS કરતા વધારે હોય ત્યારે પ્રક્રિયા ખૂબ જ અનુકૂળ હોય છે.એલએલપી પણ રાસાયણિક રીતે અલગ ડિસ્પ્લેસિંગ એજન્ટ ડેક્સ્ટ્રાન-70 (70 kDa) નો ઉપયોગ કરીને અથવા ગ્લાસ સ્લાઇડ ડ્રોપ્સ, વિવિધ સામગ્રીના માઇક્રોપ્લેટ કુવાઓ, એપેન્ડોર્ફ અથવા ક્વાર્ટઝ રુધિરકેશિકાઓ સહિત વિવિધ નમૂનાના ફોર્મેટનો ઉપયોગ કરીને જોવામાં આવ્યા છે.
આ અભ્યાસમાં ઉપયોગમાં લેવાતા WT-αS અને ΔCt-αS ચલોમાં વિવિધ પ્રોટીન પ્રદેશોની યોજનાકીય રજૂઆત.એમ્ફીપેથિક એન-ટર્મિનલ ડોમેન, હાઇડ્રોફોબિક એમીલોઇડ-ફોર્મિંગ (એનએસી) ક્ષેત્ર અને નકારાત્મક રીતે ચાર્જ થયેલ સી-ટર્મિનલ ડોમેન અનુક્રમે વાદળી, નારંગી અને લાલ રંગમાં બતાવવામાં આવે છે.WT-αS નો નેટ ચાર્જ પ્રતિ શેષ (NCPR) નકશો બતાવવામાં આવ્યો છે.b મેક્રોમોલેક્યુલર ક્લમ્પ્સની ગેરહાજરીમાં αS/pLK ક્રિયાપ્રતિક્રિયાનું NMR વિશ્લેષણ.જેમ જેમ pLK સાંદ્રતા વધે છે (αS:pLK દાઢ ગુણોત્તર 1:0.5, 1:1.5 અને 1:10 અનુક્રમે હળવા લીલા, લીલા અને ઘેરા લીલા રંગમાં બતાવવામાં આવે છે).c એલએલપીએસ બફર (ટોચ) માં 25 µM (1 µM AF488-લેબલ αS અથવા Atto647N-લેબલવાળા pLK) પર LLPS બફર (ટોચ) પર કોસેર્વેટ αS/pLK (મોલર રેશિયો 1:10) અથવા 500 mMtobot સાથે પૂરક અથવા ડાબે (ડાબે) % 1,6-hexanediol (1,6-HD; નીચે જમણે).સ્કેલ બાર = 20 µm.d 25 μM ની સાંદ્રતા પર αS/pLK (મોલર રેશિયો 1:10) ના BF ટીપું ફ્યુઝનની પ્રતિનિધિ માઇક્રોસ્કોપિક છબીઓ;તીરો વ્યક્તિગત ટીપાં (લાલ અને પીળા તીરો) ને 200 ms ની અંદર નવા ડ્રોપ (નારંગી તીર) માં મર્જ કરવાનું સૂચવે છે).સ્કેલ બાર = 20 µm.e લાઇટ સ્કેટરિંગ (350 nm પર) 25 µM αS પર 500 mM NaCl અથવા 10% 1,6-HD ઉમેરતા પહેલા અને પછી LLPS બફરમાં αS/pLK એકત્રીકરણ (N = 3 નમૂનાની નકલ, સરેરાશ અને પ્રમાણભૂત વિચલન પણ દર્શાવેલ છે).f BF ઇમેજ (ટોચ) અને 25 μM αS પર αS/pLK એકત્રીકરણનું પ્રકાશ સ્કેટરિંગ વિશ્લેષણ (350 nm પર, નીચે) αS:pLK મોલર રેશિયો (N = 3 નમૂનાની નકલ, સરેરાશ અને પ્રમાણભૂત વિચલન પણ સૂચવવામાં આવે છે) સાથે 25 μM αS પર.સ્કેલ બાર = 10 µm.એક ઈમેજ પરનો સ્કેલ બાર એક પેનલમાંની તમામ ઈમેજનો સ્કેલ દર્શાવે છે.કાચો ડેટા કાચા ડેટા ફાઇલોના સ્વરૂપમાં પ્રદાન કરવામાં આવે છે.
αS/pLK ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક કોમ્પ્લેક્સ કન્ડેન્સેશનના અમારા અવલોકનો અને tau31 સાથે સીધી ક્રિયાપ્રતિક્રિયા દ્વારા tau/RNA કન્ડેન્સેટના ક્લાયંટ પરમાણુ તરીકે αS ના અગાઉના અવલોકનોના આધારે, અમે અનુમાન કર્યું કે αS અને tau RNA ની ગેરહાજરીમાં દ્રાવક સાથે સહ-અલગ થઈ શકે છે. ઘનીકરણઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક કોમ્પ્લેક્સ દ્વારા, અને αS એ αS/Tau coacervates માં સ્કેફોલ્ડ પ્રોટીન છે (આકૃતિ 2e માં ટાઉ ચાર્જ વિતરણ જુઓ).અમે અવલોકન કર્યું કે જ્યારે 10 μM αS અને 10 μM Tau441 (અનુક્રમે 1 μM AF488-αS અને 1 μM Atto647N-Tau સમાવે છે) LLPS બફરમાં એકસાથે મિશ્રિત કરવામાં આવ્યા હતા, ત્યારે તેઓ સરળતાથી બંને પ્રોટીન ધરાવતા પ્રોટીન એગ્રીગેટ્સ બનાવે છે, જેમ કે WF માઇક્રોસ્કોપી દ્વારા જોવામાં આવ્યું છે.(ફિગ. 2a).ટીપાંમાં બે પ્રોટીનનું સ્થાનિકીકરણ કોન્ફોકલ (CF) માઇક્રોસ્કોપી (પૂરક ફિગ. 1a) દ્વારા પુષ્ટિ કરવામાં આવ્યું હતું.જ્યારે ડેક્સ્ટ્રાન-70 નો ઉપયોગ એકત્રીકરણ એજન્ટ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો ત્યારે સમાન વર્તન જોવા મળ્યું હતું (પૂરક ફિગ. 1c).FITC-લેબલવાળા PEG અથવા dextran નો ઉપયોગ કરીને, અમે જોયું કે બંને ક્રાઉડિંગ એજન્ટો સમગ્ર નમૂનાઓમાં સમાનરૂપે વિતરિત કરવામાં આવ્યા હતા, જે ન તો અલગતા કે જોડાણ દર્શાવે છે (પૂરક ફિગ. 1d).તેના બદલે, તે સૂચવે છે કે આ સિસ્ટમમાં તેઓ મેક્રોમોલેક્યુલર ક્રાઉડિંગ ઇફેક્ટ્સ દ્વારા તબક્કાના વિભાજનને પ્રોત્સાહન આપે છે, કારણ કે PEG એ પ્રાધાન્યમાં સ્થિર ક્રાઉડિંગ એજન્ટ છે, જેમ કે અન્ય LLP સિસ્ટમ્સ 33,34માં જોવા મળે છે.આ પ્રોટીન-સમૃદ્ધ ટીપું NaCl (1 M) પ્રત્યે સંવેદનશીલ હતા પરંતુ 1,6-HD (10% v/v) માટે નહીં, તેમના ઈલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ગુણધર્મોની પુષ્ટિ કરતા હતા (પૂરક ફિગ. 2a, b).BF માઈક્રોસ્કોપી (ફિગ. 2b) નો ઉપયોગ કરીને મિલિસેકન્ડ મર્જિંગ ટીપું ઘટનાઓનું અવલોકન કરીને તેમના પ્રવાહી વર્તનની પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી.
એલએલપીએસ બફરમાં αS/Tau441 કોસર્વેટ્સની કોન્ફોકલ (CF) માઈક્રોસ્કોપી ઈમેજીસ (દરેક પ્રોટીનનું 10 μM, AF488-લેબલ αS નું 0.5 μM અને Atto647N-લેબલ Tau441).b αS/Tau441 ડ્રોપલેટ ફ્યુઝન ઇવેન્ટ્સની પ્રતિનિધિ વિભેદક હસ્તક્ષેપ કોન્ટ્રાસ્ટ (DIC) છબીઓ (દરેક પ્રોટીન માટે 10 μM).50 µM αS ની ગેરહાજરીમાં (ડાબે) અથવા હાજરી (જમણે) Tau441 LLPS (0–15 µM) ના પ્રકાશ સ્કેટરિંગ (350 nm પર) પર આધારિત c ફેઝ ડાયાગ્રામ.ગરમ રંગો વધુ છૂટાછવાયા સૂચવે છે.d વધતી αS સાંદ્રતા સાથે αS/Tau441 LLPS નમૂનાઓનું આછું સ્કેટરિંગ (5 µM પર Tau441, N = 2–3 નમૂનાના પુનરાવર્તનો દર્શાવેલ છે).e આ અભ્યાસમાં ઉપયોગમાં લેવાતા કેટલાક ટાઉ પ્રોટીન વેરિઅન્ટ્સ અને પ્રોટીનના વિવિધ ક્ષેત્રોની યોજનાકીય રજૂઆત: નકારાત્મક રીતે ચાર્જ થયેલ એન-ટર્મિનલ ડોમેન (લાલ), પ્રોલાઇન-સમૃદ્ધ પ્રદેશ (વાદળી), માઇક્રોટ્યુબ્યુલ-બંધનકર્તા ડોમેન (MTBD, નારંગીમાં પ્રકાશિત), અને એમીલોઇડ બનાવતી જોડી સર્પાકાર.ફિલામેન્ટ પ્રદેશો (PHF) MTBD (ગ્રે) ની અંદર સ્થિત છે.Tau441 નો નેટ ચાર્જ પ્રતિ અવશેષ (NCPR) નકશો બતાવવામાં આવ્યો છે.f 1 µM AF488-લેબલવાળા αS અને Atto647N-લેબલવાળા ΔNt-નો ઉપયોગ કરીને, ΔNt-Tau (ટોચ, 10 µM પ્રતિ પ્રોટીન) અથવા K18 (પ્રોટીન દીઠ µM, 10 µM) ની હાજરીમાં 1 µM AF488-લેબલવાળા αS અથવા ΔCt-αS નો ઉપયોગ કરીને ) ) ) LLPS અથવા K18 બફરમાં કન્ડેન્સ્ડ WF ના માઇક્રોગ્રાફ્સ.એક ઈમેજમાંના સ્કેલ બાર એક પેનલમાં તમામ ઈમેજનો સ્કેલ દર્શાવે છે (પેનલ a, b અને f માટે 20 µm).પેનલ્સ c અને d માટે કાચો ડેટા કાચો ડેટા ફાઇલો તરીકે પ્રદાન કરવામાં આવે છે.
આ LLPS પ્રક્રિયામાં αS ની ભૂમિકા ચકાસવા માટે, અમે સૌપ્રથમ NaCl (ફિગ. 2c) ની વધતી સાંદ્રતાનો ઉપયોગ કરીને નેફેલોમેટ્રી દ્વારા ટીપું સ્થિરતા પર αS ની અસરની તપાસ કરી.αS ધરાવતા નમૂનાઓમાં મીઠાની સાંદ્રતા જેટલી વધારે છે, પ્રકાશ સ્કેટરિંગ મૂલ્યો (350 nm પર) વધારે છે, જે આ LLPS સિસ્ટમમાં αS ની સ્થિર ભૂમિકા સૂચવે છે.સમાન અસર αS સાંદ્રતા (અને તેથી αS:Tau441 ગુણોત્તર) ને આશરે વધારીને જોઈ શકાય છે.ટાઉ સાંદ્રતા (5 µM) (ફિગ. 2d) ની તુલનામાં 10-ગણો વધારો.કોસર્વેટ્સમાં αS એ સ્કેફોલ્ડ પ્રોટીન છે તે દર્શાવવા માટે, અમે LLPS-વિક્ષેપિત ટાઉ મ્યુટન્ટની વર્તણૂકની તપાસ કરવાનું નક્કી કર્યું, જેમાં નકારાત્મક રીતે ચાર્જ થયેલ N-ટર્મિનલ પ્રદેશ (અવશેષો 1–150, ફિગ. 2e જુઓ) નો અભાવ છે જેને ΔNt-Tau કહેવાય છે.WF માઈક્રોસ્કોપી અને નેફેલોમેટ્રીએ પુષ્ટિ કરી છે કે ΔNt-Tau પોતે LLPS (ફિગ. 2f અને પૂરક ફિગ. 2d) માંથી પસાર થયું નથી, જેમ કે અગાઉ 14 નોંધવામાં આવ્યું હતું. જો કે, જ્યારે αS ને આ કપાયેલા ટાઉ વેરિઅન્ટના વિક્ષેપ ઉકેલોમાં ઉમેરવામાં આવ્યું હતું, ત્યારે LLPS પ્રક્રિયા સંપૂર્ણપણે થઈ ગઈ હતી. સમાન પરિસ્થિતિઓ અને પ્રોટીન સાંદ્રતા હેઠળ Tau અને αS ના પૂર્ણ-કદના ઉકેલોની ટીપું ઘનતાની નજીકના ટીપું ઘનતા સાથે પુનઃસ્થાપિત.આ પ્રક્રિયા ઓછી મેક્રોમોલેક્યુલર ભીડ (પૂરક ફિગ. 2c) ની સ્થિતિમાં પણ જોઇ શકાય છે.સી-ટર્મિનલ αS પ્રદેશની ભૂમિકા, પરંતુ તેની સમગ્ર લંબાઈ નહીં, LLPS પ્રક્રિયામાં (ΔCt-) ના અવશેષો 104-140 (ફિગ. 1a) ના અભાવે સી-ટર્મિનલ ટ્રંકેટેડ αS વેરિઅન્ટનો ઉપયોગ કરીને ટીપું રચનાના અવરોધ દ્વારા દર્શાવવામાં આવ્યું હતું. αS) પ્રોટીન (ફિગ. 2f અને પૂરક ફિગ. 2d).αS અને ΔNt-Tau ના સ્થાનિકીકરણની પુષ્ટિ કોન્ફોકલ ફ્લોરોસેન્સ માઇક્રોસ્કોપી (પૂરક ફિગ. 1b) દ્વારા કરવામાં આવી હતી.
Tau441 અને αS વચ્ચેના LLPS મિકેનિઝમને વધુ ચકાસવા માટે, વધારાના Tau વેરિઅન્ટનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો, એટલે કે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ-બાઈન્ડિંગ ડોમેન (MTBD) માં પેર્ડ હેલિકલ ફિલામેન્ટ કોર (PHF) ફ્રેગમેન્ટ, જે જો તેમાં ચાર લાક્ષણિકતા પુનરાવર્તિત ડોમેન્સ હોય, તો તે સામાન્ય રીતે ઓળખાય છે. K18 ટુકડા તરીકે (ફિગ 2e જુઓ).તાજેતરમાં એવું નોંધવામાં આવ્યું છે કે αS પ્રાથમિક રૂપે પ્રોલાઇન-સમૃદ્ધ ડોમેનમાં સ્થિત ટાઉ પ્રોટીન સાથે જોડાય છે જે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ-બંધનકર્તા ડોમેનની આગળ આવે છે.જો કે, PHF પ્રદેશ હકારાત્મક રીતે ચાર્જ થયેલા અવશેષોથી પણ સમૃદ્ધ છે (જુઓ આકૃતિ 2e), ખાસ કરીને લાયસિન (15% અવશેષો), જેણે અમને ચકાસવા માટે પ્રોત્સાહિત કર્યા કે આ પ્રદેશ αS/Tau સંકુલના ઘનીકરણમાં પણ ફાળો આપે છે કે કેમ.અમે અવલોકન કર્યું છે કે એકલા K18 100 μM સુધીની સાંદ્રતામાં LLPS ને ચકાસાયેલ શરતો (15% PEG અથવા 20% dextran સાથે LLPS બફર) (આકૃતિ 2f) હેઠળ ટ્રિગર કરી શકતું નથી.જો કે, જ્યારે અમે 50 µM K18 માં 50 µM αS ઉમેર્યું, ત્યારે K18 અને αS ધરાવતા પ્રોટીન ટીપાંની ઝડપી રચના નેફેલોમેટ્રી (પૂરક ફિગ. 2d) અને WF માઈક્રોસ્કોપી (ફિગ. 2f) દ્વારા જોવા મળી હતી.અપેક્ષા મુજબ, ΔCt-αS K18 (ફિગ. 2f) ના LLPS વર્તનને પુનઃસ્થાપિત કરવામાં અસમર્થ હતું.અમે નોંધીએ છીએ કે αS/ΔNt-Tau અથવા αS/Tau441 ની તુલનામાં αS/K18 એકત્રીકરણને LLPS પ્રેરિત કરવા માટે થોડી વધારે પ્રોટીન સાંદ્રતાની જરૂર છે, અન્ય વસ્તુઓ સમાન છે.આ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ-બંધનકર્તા ડોમેનની તુલનામાં પ્રોલાઇન-સમૃદ્ધ ટાઉ ડોમેન સાથે αS C-ટર્મિનલ પ્રદેશની મજબૂત ક્રિયાપ્રતિક્રિયા સાથે સુસંગત છે, જેમ કે અગાઉ 31 માં વર્ણવવામાં આવ્યું હતું.
આપેલ છે કે ΔNt-Tau αS ની ગેરહાજરીમાં LLPS કરી શકતું નથી, અમે αS/Tau LLPS ની લાક્ષણિકતા માટે મોડેલ તરીકે આ Tau વેરિઅન્ટને પસંદ કર્યું છે, કારણ કે સંપૂર્ણ-લંબાઈના Tau (isotype, Tau441/Tau441) સાથે LLPS સિસ્ટમ્સમાં તેની સરળતાને જોતાં.જટિલ (હેટરોટાઇપિક, αS/Tau441) એકત્રીકરણ પ્રક્રિયાઓ સાથે.અમે αS/Tau અને αS/ΔNt-Tau સિસ્ટમમાં સેન્ટ્રીફ્યુગેશન અને વિખેરાયેલા તબક્કાના SDS-PAGE વિશ્લેષણ (જુઓ 2e)માં αS એકત્રીકરણની ડિગ્રી (કન્ડેન્સ્ડ ફેઝ પ્રોટીન, fαS,cના ભાગ રૂપે) ની તુલના કરી, ખૂબ સમાન મૂલ્યો મળ્યાં. સમાન સાંદ્રતામાં બધા પ્રોટીન માટે.ખાસ કરીને, અમે αS/Tau અને αS/ΔNt-Tau માટે અનુક્રમે fαS,c 84 ± 2% અને 79 ± 7% મેળવ્યા છે, જે સૂચવે છે કે αS અને tau વચ્ચેની વિષમતાપૂર્ણ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા ટાઉ પરમાણુઓ વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરતાં શ્રેષ્ઠ છે.વચ્ચે
વિવિધ પોલિકેશન્સ સાથેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા અને αS ગતિશાસ્ત્ર પર ઘનીકરણ પ્રક્રિયાની અસરનો પ્રથમ ફોટોબ્લીચિંગ (FRAP) પદ્ધતિ પછી ફ્લોરોસેન્સ રિકવરી દ્વારા અભ્યાસ કરવામાં આવ્યો હતો.અમે αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau અને αS/pLK coacervates (100 μM αS 2 μM αS AF488-αS અને 100 μM Tau441 અથવા ΔNt-Tau અથવા 1 mM pLK સાથે પૂરક) નું પરીક્ષણ કર્યું.નમૂનાના ઘટકોને મિશ્રિત કર્યા પછી પ્રથમ 30 મિનિટમાં ડેટા મેળવવામાં આવ્યો હતો.પ્રતિનિધિ FRAP છબીઓ (ફિગ. 3a, αS/Tau441 કન્ડેન્સેશન) અને તેમના અનુરૂપ સમય અભ્યાસક્રમ વણાંકો (ફિગ. 3b, પૂરક ફિગ. 3) પરથી જોઈ શકાય છે કે αS ગતિશાસ્ત્ર Tau441 કોસરવેટ્સ સાથે ખૂબ સમાન છે.અને ΔNt-Tau, જે pLK સાથે ખૂબ ઝડપી છે.એફઆરએપી (કેંગ એટ અલ. 35 દ્વારા વર્ણવ્યા મુજબ) કોસરવેટની અંદર αS માટે ગણતરી કરેલ પ્રસરણ ગુણાંક D = 0.013 ± 0.009 µm2/s અને D = 0.026 ± 0.008 µm2/s αS/TauΔ માટે αS/TauΔ માટે છે. αS/ સિસ્ટમ.pLK, Tau, અને D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, અનુક્રમે (ફિગ. 3c).જો કે, વિખરાયેલા તબક્કામાં પ્રસરણ ગુણાંક αS એ સમાન શરતો (LLPS બફર) હેઠળ ફ્લોરોસેન્સ કોરિલેશન સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી (FCS, જુઓ પૂરક ફિગ. 3) દ્વારા નિર્ધારિત તમામ કન્ડેન્સ્ડ તબક્કાઓ કરતાં વધુ તીવ્રતાના કેટલાક ઓર્ડર છે પરંતુ પોલિકેશનની ગેરહાજરીમાં. ( D = 8 ± 4 µm2/s).તેથી, ઉચ્ચારણ પરમાણુ ભીડની અસરોને કારણે વિખરાયેલા તબક્કામાં પ્રોટીનની સરખામણીમાં αS અનુવાદની ગતિશાસ્ત્ર નોંધપાત્ર રીતે ઘટે છે, જો કે તમામ કોસર્વેટ તેમની રચના પછીના પ્રથમ અડધા કલાક દરમિયાન પ્રવાહી જેવા ગુણો જાળવી રાખે છે, તાઉ તબક્કાથી વિપરીત.pLK કન્ડેન્સેટમાં ઝડપી ગતિશાસ્ત્ર.
ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક કોસેર્વેટ્સમાં αS ડાયનેમિક્સ (2% AF488-લેબલ αS) નું a–c FRAP વિશ્લેષણ.αS/Tau441 FRAP એસેસની ટ્રિપ્લિકેટમાં પ્રતિનિધિ છબીઓ (a), જ્યાં લાલ વર્તુળો રંગીન વિસ્તારો દર્શાવે છે.સ્કેલ બાર 5 µm છે.b સરેરાશ FRAP વણાંકો અને (c) 100 µM αS અને Tau441 (લાલ) અથવા ΔNt-Tau (વાદળી) અથવા pLK (લીલા) ની સમાન સાંદ્રતાનો ઉપયોગ કરીને ત્રણ પ્રયોગોમાંથી 5-6 (N) વિવિધ ટીપાં માટે ગણતરી કરેલ પ્રસરણ ગુણાંક (D) એલએલપીએસની સાંદ્રતાના દસ ગણા પર.FRAP વળાંકનું પ્રમાણભૂત વિચલન છાંયેલા રંગમાં બતાવવામાં આવે છે.સરખામણી માટે, વિખરાયેલા તબક્કામાં પ્રસરણ ગુણાંક αS ફ્લોરોસેન્સ કોરિલેશન સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી (FCS) નો ઉપયોગ કરીને ત્રિપુટીમાં નિર્ધારિત કરવામાં આવ્યો હતો (વધુ માહિતી માટે પૂરક આકૃતિ 3 અને પદ્ધતિઓ જુઓ).d કોઈપણ પોલિકેશન (કાળા) વિના અથવા 100 μM Tau441 (લાલ) અથવા ΔNt-Tau (વાદળી) અથવા 1 mM pLK (લીલો) ની હાજરીમાં LLPS બફરમાં 100 μM TEMPOL-122-αS નો સતત X-બેન્ડ EPR સ્પેક્ટ્રા.ઇનસેટ મજબૂત ક્ષેત્ર રેખાઓનું વિસ્તૃત દૃશ્ય દર્શાવે છે જ્યાં સૌથી વધુ નાટકીય ફેરફારો થાય છે.e LLPS (કોઈ PEG) ની ગેરહાજરીમાં વિવિધ પોલિકેશન સાથે 50 μM TEMPOL-122-αS ના બંધનકર્તા વળાંક.સામાન્યકૃત EPR સ્પેક્ટ્રમના બેન્ડ II (IIII/III) ની તુલનામાં બેન્ડ III નું ઘટેલું કંપનવિસ્તાર Tau441 (લાલ), ΔNt-Tau (વાદળી) અને pLK (લીલા) ના દાઢ ગુણોત્તરમાં વધારો દર્શાવે છે.રંગીન રેખાઓ દરેક વળાંક પર n સમાન અને સ્વતંત્ર બંધનકર્તા સાઇટ્સ સાથે રફ બાઈન્ડિંગ મોડેલનો ઉપયોગ કરીને ડેટા માટે યોગ્ય દર્શાવે છે.કાચો ડેટા કાચા ડેટા ફાઇલોના સ્વરૂપમાં પ્રદાન કરવામાં આવે છે.
પૂરક તરીકે, અમે નિર્દેશિત સ્પિન લેબલિંગ (SDSL) અને સતત ઇલેક્ટ્રોન પેરામેગ્નેટિક રેઝોનન્સ (CW-EPR) નો ઉપયોગ કરીને વિવિધ કોસર્વેટ્સમાં αS ની ગતિશીલતાની તપાસ કરી.આ પદ્ધતિ વાસ્તવિક શેષ રીઝોલ્યુશન 36,37,38 સાથે IDP ની લવચીકતા અને ગતિશીલતાની જાણ કરવામાં ખૂબ જ ઉપયોગી સાબિત થઈ છે.આ માટે, અમે સિંગલ સાયસ મ્યુટન્ટ્સમાં સિસ્ટીન અવશેષોનું નિર્માણ કર્યું અને 4-હાઈડ્રોક્સી-2,2,6,6-ટેટ્રામેથાઈલપીપેરીડિન-એન-ઓક્સીલ (TEMPOL) સ્પિન પ્રોબનો ઉપયોગ કર્યો.Maleimide ડેરિવેટિવ્સ તેમને લેબલ કરે છે.વધુ વિશિષ્ટ રીતે, અમે 122 અથવા 24 αS (TEMPOL-122-αS અને TEMPOL-24-αS) સ્થિતિ પર TEMPOL ચકાસણીઓ દાખલ કરી છે.પ્રથમ કિસ્સામાં, અમે પ્રોટીનના સી-ટર્મિનલ પ્રદેશને લક્ષ્ય બનાવીએ છીએ, જે પોલિકેશન્સ સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયામાં સામેલ છે.તેના બદલે, સ્થિતિ 24 અમને કન્ડેન્સેટમાં પ્રોટીનની એકંદર ગતિશીલતા વિશે માહિતી આપી શકે છે.બંને કિસ્સાઓમાં, વિખરાયેલા તબક્કાના પ્રોટીન માટે મેળવેલા EPR સંકેતો ઝડપી ગતિશીલ સ્થિતિમાં નાઇટ્રોક્સાઇડ રેડિકલને અનુરૂપ છે.તાઉ અથવા pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 અથવા ΔNt-Tau 1:1 ના ગુણોત્તરમાં અથવા 1:10 ના ગુણોત્તરમાં pLK) ની હાજરીમાં તબક્કાના વિભાજન પછી, સંબંધિત ટોચની તીવ્રતામાં વધારો જોવા મળ્યો હતો. αS નું EPR સ્પેક્ટ્રમ.ખોટની રેખા વિસ્તરી છે, જે પાતળું તબક્કામાં પ્રોટીનની સરખામણીમાં ટીપાંમાં αS પુનઃઓરિએન્ટેશન ગતિવિજ્ઞાન દર્શાવે છે (ફિગ. 3d, પૂરક ફિગ. 4a).આ ફેરફારો પોઝિશન 122 પર વધુ સ્પષ્ટ થાય છે. જ્યારે પોઝિશન 24 પર pLK ની હાજરી પ્રોબના ગતિશાસ્ત્રને અસર કરતી નથી, પોઝિશન 122 પર વર્ણપટ રેખાનો આકાર નોંધપાત્ર રીતે બદલાઈ ગયો (પૂરક ફિગ. 4a).જ્યારે અમે સ્પિન-લેબલવાળી IDP38,39 ની ગતિશીલતાનું વર્ણન કરવા માટે સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતા આઇસોટ્રોપિક મોડલ (પૂરક આકૃતિ 5a) નો ઉપયોગ કરીને બે αS/પોલીકેશન સિસ્ટમ્સના 122 પોઝિશન પર સ્પેક્ટ્રાને મોડલ કરવાનો પ્રયાસ કર્યો, ત્યારે અમે પ્રાયોગિક સ્પેક્ટ્રાનું પુનર્નિર્માણ કરવામાં અસમર્થ હતા..24 સ્પિન કોન્ટ્રાસ્ટની સ્થિતિનું સ્પેક્ટ્રલ સિમ્યુલેશન (પૂરક ફિગ. 5a).આ સૂચવે છે કે પોલિકેશનની હાજરીમાં αS ના C-ટર્મિનલ પ્રદેશના સ્પિન કન્ફિગરેશનની જગ્યામાં પ્રેફરન્શિયલ પોઝિશન્સ છે.પ્રાયોગિક EPR શરતો હેઠળ કન્ડેન્સ્ડ તબક્કામાં αS ના અપૂર્ણાંકને ધ્યાનમાં લેતી વખતે (αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, અને αS/pLK માટે 84 ± 2%, 79 ± 7%, અને 47 ± 4% અનુક્રમે-જુઓ પૂરક ડેટા વિશ્લેષણ c ની ફિગ. 2e), તે જોઈ શકાય છે કે EPR પદ્ધતિ દ્વારા શોધાયેલ વિસ્તૃતીકરણ મુખ્યત્વે αS ના C-ટર્મિનલ પ્રદેશની સંક્ષિપ્ત તબક્કામાં વિવિધ પોલિકેશન સાથેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને પ્રતિબિંબિત કરે છે (TEMPOL-122-નો ઉપયોગ કરતી વખતે મુખ્ય ફેરફાર. αS), અને પ્રોટીન ઘનીકરણ નહીં.તપાસમાં માઇક્રોવિસ્કોસિટીમાં વધારો જોવા મળે છે.અપેક્ષા મુજબ, જ્યારે મિશ્રણમાં 1 M NaCl ઉમેરવામાં આવ્યું ત્યારે LLPS સિવાયની પરિસ્થિતિઓમાં પ્રોટીનનું EPR સ્પેક્ટ્રમ સંપૂર્ણપણે પુનઃસ્થાપિત થયું હતું (પૂરક ફિગ. 4b).એકંદરે, અમારો ડેટા સૂચવે છે કે CW-EPR દ્વારા શોધાયેલ ફેરફારો મુખ્યત્વે αS ના C-ટર્મિનલ પ્રદેશની સંક્ષિપ્ત તબક્કામાં વિવિધ પોલિકેશન સાથેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને પ્રતિબિંબિત કરે છે, અને આ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા ટાઉ સાથે કરતાં pLK સાથે વધુ મજબૂત હોવાનું જણાય છે.
કોસર્વેટમાં પ્રોટીન વિશે વધુ માળખાકીય માહિતી મેળવવા માટે, અમે ઉકેલમાં NMR નો ઉપયોગ કરીને LLPS સિસ્ટમનો અભ્યાસ કરવાનું નક્કી કર્યું.જો કે, અમે વિખરાયેલા તબક્કામાં બાકી રહેલા αS અપૂર્ણાંકને જ શોધી શક્યા છીએ, જે કોસરવેટની અંદર પ્રોટીનની ગતિશીલતામાં ઘટાડો અને NMR વિશ્લેષણમાં ઉકેલના તળિયે એક ગાઢ તબક્કાને કારણે હોઈ શકે છે.જ્યારે અમે NMR (પૂરક ફિગ. 5c, d) નો ઉપયોગ કરીને LLPS નમૂનાના વિખરાયેલા તબક્કામાં બાકી રહેલા પ્રોટીનની રચના અને ગતિશીલતાનું વિશ્લેષણ કર્યું, ત્યારે અમે નોંધ્યું કે પ્રોટીન pLK અને ΔNt-Tau, બંનેની હાજરીમાં લગભગ સમાન રીતે વર્તે છે. જે પ્રોટીન બેકબોનની ગૌણ રચના અને ગતિશીલતામાં હતા, જે ગૌણ રાસાયણિક પાળી અને R1ρ છૂટછાટ પરના પ્રયોગો દ્વારા પ્રગટ થાય છે.NMR ડેટા દર્શાવે છે કે αS નું C-ટર્મિનસ પોલીકેશન્સ સાથેની તેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને કારણે, બાકીના પ્રોટીન ક્રમની જેમ, તેના અવ્યવસ્થિત સ્વભાવને જાળવી રાખતી વખતે રચનાત્મક સુગમતામાં નોંધપાત્ર નુકસાન સહન કરે છે.
TEMPOL-122-αS કન્ડેન્સ્ડ તબક્કામાં જોવા મળેલ CW-EPR સિગ્નલનું વિસ્તરણ પોલીકેશન્સ સાથે પ્રોટીનની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને પ્રતિબિંબિત કરે છે, તેથી અમે LLPS ની ગેરહાજરીમાં વિવિધ પોલિકેશન્સ સાથે αS ની બંધનકર્તા જોડાણનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે EPR ટાઇટ્રેશન કર્યું (કોઈ સંચય નથી. બફર એલએલપીએસ), સૂચવે છે કે ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ પાતળા અને કેન્દ્રિત તબક્કાઓમાં સમાન છે (જેની પુષ્ટિ અમારા ડેટા દ્વારા થાય છે, પૂરક ફિગ. 4a અને પૂરક ફિગ. 6).ધ્યેય એ જોવાનું હતું કે શું તમામ કોસર્વેટ, તેમના સામાન્ય પ્રવાહી જેવા ગુણધર્મો હોવા છતાં, પરમાણુ સ્તરે કોઈપણ અંતર્ગત વિભેદક વર્તન દર્શાવે છે.અપેક્ષા મુજબ, EPR સ્પેક્ટ્રમ વધતા પોલિકેશન સાંદ્રતા સાથે વિસ્તર્યું, જે લગભગ સંતૃપ્તિ સુધીના તમામ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા ભાગીદારોની પરમાણુ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને કારણે પરમાણુ લવચીકતામાં ઘટાડો દર્શાવે છે (ફિગ. 3e, પૂરક ફિગ. 6).pLK એ ΔNt-Tau અને Tau441 ની તુલનામાં નીચા મોલર રેશિયો (પોલીકેશન:αS) પર આ સંતૃપ્તિ હાંસલ કરી.વાસ્તવમાં, n સમાન અને સ્વતંત્ર બંધનકર્તા સાઇટ્સ ધારીને અંદાજિત બંધનકર્તા મોડલ સાથેના ડેટાની સરખામણી દર્શાવે છે કે pLK (~5 μM) નું દેખીતું વિયોજન સ્થિરાંક Tau441 અથવા ΔNt-Tau (~50 μM) કરતાં નીચું તીવ્રતાનો ક્રમ છે. ).µM).જો કે આ એક સ્થૂળ અંદાજ છે, આ સૂચવે છે કે αS સતત હકારાત્મક ચાર્જ વિસ્તારો સાથે સરળ પોલિકેશન્સ માટે ઉચ્ચ આકર્ષણ ધરાવે છે.αS અને વિવિધ પોલિકેશન્સ વચ્ચેના સંબંધમાં આ તફાવતને જોતાં, અમે અનુમાન કર્યું છે કે તેમના પ્રવાહી ગુણધર્મો સમય સાથે અલગ રીતે બદલાઈ શકે છે અને તેથી વિવિધ LSPT પ્રક્રિયાઓથી પીડાય છે.
પ્રોટીન કોસરવેટની અંદર અત્યંત ભીડવાળા વાતાવરણ અને પ્રોટીનની એમાયલોઇડ પ્રકૃતિને જોતાં, અમે સંભવિત LSPT પ્રક્રિયાઓને શોધવા માટે સમય જતાં કોસરવેટની વર્તણૂકનું અવલોકન કર્યું.BF અને CF માઈક્રોસ્કોપી (આકૃતિ 4) નો ઉપયોગ કરીને, અમે અવલોકન કર્યું કે αS/Tau441 દ્રાવણમાં મોટી માત્રામાં કોસર્વેટ કરે છે, જે મોટા ટીપાં બનાવે છે જે કૂવા/સ્લાઈડના તળિયે સપાટીને સંપર્ક કરે છે અને ભીની કરે છે, અપેક્ષા મુજબ (પૂરક ફિગ. 7d);અમે આ તળિયાની રચનાને "પ્રોટીન રાફ્ટ્સ" કહીએ છીએ.આ રચનાઓ પ્રવાહી રહી કારણ કે તેઓ ફ્યુઝ કરવાની ક્ષમતા જાળવી રાખે છે (પૂરક ફિગ. 7b) અને LLPS ટ્રિગર થયા પછી કેટલાક કલાકો સુધી જોઈ શકાય છે (ફિગ. 4 અને પૂરક ફિગ. 7c).અમે અવલોકન કર્યું છે કે અસંતુલિત ચાર્જ અને તેથી ઉચ્ચ ઈલેક્ટ્રોસ્ટેટિક સપાટીની સંભવિતતાવાળા ઈલેક્ટ્રોસ્ટેટિક કોસર્વેટ્સની અપેક્ષા મુજબ હાઈડ્રોફોબિક પદાર્થો (પૂરક ફિગ. 7a) ને બદલે હાઈડ્રોફિલિકની સપાટી પર ભીનાશની પ્રક્રિયા વધુ અનુકૂળ છે.નોંધનીય રીતે, αS/ΔNt-Tau સંકલન અને રાફ્ટિંગમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો થયો હતો, જ્યારે αS/pLK કન્ડેન્સેટમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો થયો હતો (ફિગ. 4).ટૂંકા ઇન્ક્યુબેશન સમય દરમિયાન, αS/pLK ટીપાઓ હાઇડ્રોફિલિક સપાટીને એકીકૃત કરવામાં અને ભીની કરવામાં સક્ષમ હતા, પરંતુ આ પ્રક્રિયા ઝડપથી બંધ થઈ ગઈ અને 5 કલાકના સેવન પછી, માત્ર મર્યાદિત સંકલન ઘટનાઓ અને ભીનાશ જોવા મળી ન હતી.- જેલ-ડ્રિપ સંક્રમણ.
LLPS બફરમાં 100 µM αS (1% ફ્લોરોસન્ટ લેબલ) ધરાવતા કોસેર્વેટ નમૂનાઓના પ્રતિનિધિ BF (ગ્રેસ્કેલ પેનલ્સ) અને CF (જમણી પેનલ્સ, AF488-લીલા રંગમાં લેબલ થયેલ αS) 100 µM માઇક્રોસોફ્ટ ઇમેજ (Tau4141) -ટાઉ (મધ્યમાં) અથવા 1 એમએમ pLK (નીચે) અલગ-અલગ ઇન્ક્યુબેશન સમયે અને કેન્દ્રીય ઊંચાઈ (z, પ્લેટના તળિયેથી અંતર)સમાન પરિણામો સાથે પ્રયોગો એકબીજાથી સ્વતંત્ર રીતે 4-6 વખત પુનરાવર્તિત થયા.αS/Tau441 coacervates 24 કલાક પછી ભીના થાય છે, જે ઇમેજ કરતા મોટા રાફ્ટ્સ બનાવે છે.બધી છબીઓ માટે સ્કેલ બાર 20 µm છે.
અમે પછી પૂછ્યું કે શું αS/Tau441 LLPS માં બનેલા મોટા પ્રવાહી જેવા પ્રોટીન પૂલ અભ્યાસ કરેલા કોઈપણ પ્રોટીનના એમીલોઇડ એકત્રીકરણ તરફ દોરી જશે.અમે WF માઈક્રોસ્કોપી સાથે સમયાંતરે αS/Tau441 ટીપાંની પરિપક્વતાને ઉપરની સમાન શરતો હેઠળ અનુસર્યા, પરંતુ 1 μM AF488-લેબલવાળા αS અને Atto647N-લેબલ Tau441 (ફિગ. 5a) નો ઉપયોગ કરીને.અપેક્ષા મુજબ, અમે પરિપક્વતા પ્રક્રિયા દરમિયાન સંપૂર્ણ પ્રોટીન સ્થાનિકીકરણનું અવલોકન કર્યું.રસપ્રદ વાત એ છે કે, સીએ તરફથી.5 કલાક પછી, રાફ્ટ્સની અંદર વધુ તીવ્ર બિન-ગોળાકાર રચનાઓ જોવા મળી હતી, જેને આપણે "બિંદુઓ" કહીએ છીએ, જેમાંથી કેટલાકને αS સાથે સ્થાનિકીકરણ કરવામાં આવ્યું હતું, અને કેટલાક Tau441 (ફિગ. 5a, સફેદ તીર) માં સમૃદ્ધ હતા.આ ફોલ્લીઓ હંમેશા αS/ΔNt-Tau માટે αS/ΔNt-Tau કરતાં વધુ હદ સુધી રાફ્ટ્સમાં જોવા મળે છે.ફ્યુઝન/ભીનાશ માટે અસમર્થ pLK અને Tau સિસ્ટમના ટીપાંમાં કોઈ વિશિષ્ટ ફોલ્લીઓ ન હતી.αS અને Tau441 ધરાવતાં આ સ્ટેન એમીલોઈડ જેવા એગ્રીગેટ્સ છે કે કેમ તે ચકાસવા માટે, અમે CF માઈક્રોસ્કોપીનો ઉપયોગ કરીને એક સમાન પ્રયોગ કર્યો જેમાં Tau441 ને Atto647N સાથે લેબલ કરવામાં આવ્યું હતું અને 12.5 μM એમીલોઈડ-વિશિષ્ટ થિયોફ્લેવિન-T (ThT) શરૂઆતથી ઉમેરવામાં આવ્યું હતું.રંગ.જો કે αS/Tau441 ટીપું અથવા રાફ્ટ્સનું ThT-સ્ટેનિંગ 24 કલાકના સેવન પછી પણ જોવા મળ્યું ન હતું (ફિગ. 5b, ટોચની પંક્તિ-પ્રોટીન રાફ્ટ્સ પર બાકીના ટીપાં), રાફ્ટ્સની અંદર Atto647N-Tau441 ધરાવતી ThT-પોઝિટિવ રચનાઓ ખૂબ નબળી હતી.આ અગાઉ વર્ણવેલ ફોલ્લીઓ (ફિગ. 5b, મધ્ય અને નીચેની પંક્તિઓ) ના કદ, આકાર અને સ્થાનની નકલ કરે છે, જે સૂચવે છે કે ફોલ્લીઓ વૃદ્ધત્વ પ્રવાહી કોસેર્વેટ્સમાં રચાયેલા એમિલોઇડ-જેવા એકંદરને અનુરૂપ હોઈ શકે છે.
WF 25 μM αS વિવિધ ઇન્ક્યુબેશન સમયે અને કેન્દ્રીય ઊંચાઈ (z, અનબાઉન્ડ તળિયેથી અંતર) 25 μM Tau441 (1 μM AF488-લેબલવાળી αS અને Atto647N-લેબલવાળી Tau441) ની હાજરીમાં LLPS buffer સાથે માઇક્રોસ્કોપ પ્લેટના કૂવામાં) .સમાન પરિણામો સાથે છ પ્રયોગો સ્વતંત્ર રીતે પુનરાવર્તિત થયા.b 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-લેબલ Tau441) અને 12.5 μM thioflavin-T (ThT) ની હાજરીમાં 25 μM αS ની CF માઇક્રોસ્કોપિક છબી.ભારિત પ્રોટીન ટીપાં અને જમા પ્રોટીન રાફ્ટ્સ અને ફોલ્લીઓ અનુક્રમે ટોચની અને મધ્ય પંક્તિઓમાં બતાવવામાં આવે છે.નીચેની પંક્તિ 3 સ્વતંત્ર પ્રતિકૃતિઓમાંથી રાફ્ટ્સ અને ડ્રોપ્સની છબીઓ બતાવે છે.સફેદ તીર બંને પેનલમાં ThT-પોઝિટિવ બિંદુઓ દર્શાવે છે.બધી છબીઓ માટે સ્કેલ બાર 20 µm છે.
પ્રવાહીમાંથી ઘન સુધીના સંક્રમણ દરમિયાન કોસેર્વેટ પ્રોટીન નેટવર્કમાં થતા ફેરફારોની વધુ વિગતવાર તપાસ કરવા માટે, અમે ફ્લોરોસેન્સ લાઇફટાઇમ ઇમેજિંગ (FLIM) અને ફૉર્સ્ટર રેઝોનન્સ એનર્જી ટ્રાન્સફર માઇક્રોસ્કોપી (FRET) (આકૃતિ 6 અને પૂરક આકૃતિઓ 8 અને 9) નો ઉપયોગ કર્યો.અમે અનુમાન લગાવ્યું છે કે સ્તરની કોસર્વેટ પરિપક્વતા વધુ કન્ડેન્સ્ડ અથવા તો ઘન-જેવી એકંદર પ્રોટીન રચનામાં પ્રોટીન અને તેની સાથે જોડાયેલ ફ્લોરોસન્ટ પ્રોબ વચ્ચે નજીકના સંપર્ક તરફ દોરી જાય છે, સંભવિત રીતે ટૂંકા પ્રોબ જીવનકાળ (τ) માં પ્રગટ થતી શમન અસર ઉત્પન્ન કરે છે. , અગાઉ વર્ણવ્યા પ્રમાણે 40.41,42.વધુમાં, ડબલ લેબલવાળા નમૂનાઓ માટે (AF488 અને Atto647N અનુક્રમે FRET દાતા અને સ્વીકારનાર રંગો તરીકે), τ માં આ ઘટાડો કોસર્વેટ કન્ડેન્સેશન અને LSPT દરમિયાન FRET(E) કાર્યક્ષમતામાં વધારો સાથે પણ હોઈ શકે છે.અમે LLPS αS/Tau441 અને αS/ΔNt-Tau નમૂનાઓ (LLPS બફરમાં 1 µM AF488 લેબલવાળા αS અને/અથવા Atto647N લેબલવાળા Tau441 અથવા ΔNt-Tau ધરાવતા દરેક પ્રોટીનના 25 µM) માં રાફ્ટ અને સ્પોટ રચનાનું નિરીક્ષણ કર્યું.અમે એક સામાન્ય વલણનું અવલોકન કર્યું છે કે AF488 (τ488) અને Atto647N (τ647N) પ્રોબ્સના ફ્લોરોસેન્સ જીવનકાળમાં થોડો ઘટાડો થયો છે કારણ કે કોસરવેટ્સ પરિપક્વ થયા છે (ફિગ. 6 અને પૂરક ફિગ. 8c).રસપ્રદ રીતે, આ ફેરફાર રાફ્ટ્સ (ફિગ. 6c) ની અંદરના બિંદુઓ માટે નોંધપાત્ર રીતે ઉન્નત કરવામાં આવ્યો હતો, જે દર્શાવે છે કે બિંદુઓ પર વધુ પ્રોટીન ઘનીકરણ થયું છે.આના સમર્થનમાં, 24 કલાક (પૂરક ફિગ. 8d) માટે વયના αS/ΔNt-Tau ટીપાં માટે ફ્લોરોસેન્સ જીવનકાળમાં કોઈ નોંધપાત્ર ફેરફાર જોવા મળ્યો ન હતો, જે સૂચવે છે કે ટીપું જીલેશન એ સ્પોટિંગથી અલગ પ્રક્રિયા છે અને તે નોંધપાત્ર પરમાણુ પુનર્ગઠન સાથે નથી. કોસર્વેટ્સની અંદર.એ નોંધવું જોઈએ કે બિંદુઓ αS માં વિવિધ કદ અને ચલ સામગ્રી ધરાવે છે, ખાસ કરીને αS/Tau441 સિસ્ટમ માટે (પૂરક ફિગ. 8e).સ્પોટ ફ્લોરોસેન્સ લાઇફટાઇમમાં ઘટાડો તીવ્રતામાં વધારો સાથે હતો, ખાસ કરીને Tau441 (પૂરક ફિગ. 8a) લેબલવાળા Atto647N માટે, અને αS/Tau441 અને αS/ΔNt-Tau બંને સિસ્ટમો માટે ઉચ્ચ FRET કાર્યક્ષમતા, જે પાંચ પીએસ કલાકમાં વધુ ઘનીકરણ સૂચવે છે. ટ્રિગર થયા પછી, સ્થિર વીજળીની અંદરના પ્રોટીન કન્ડેન્સ થાય છે.αS/ΔNt-Tau ની સરખામણીમાં, અમે αS/Tau441 સ્પોટમાં નીચા τ647N અને કંઈક અંશે ઊંચા τ488 મૂલ્યોનું અવલોકન કર્યું છે, જેની સાથે નીચલા અને વધુ અસંગત FRET મૂલ્યો છે.સંભવતઃ, આ એ હકીકત સાથે સંબંધિત હોઈ શકે છે કે αS/Tau441 સિસ્ટમમાં, એકંદરમાં અવલોકન કરેલ અને અપેક્ષિત αS વિપુલતા વધુ વિજાતીય છે, ઘણીવાર ટાઉની તુલનામાં સબસ્ટોઇકિયોમેટ્રિક છે, કારણ કે Tau441 પોતે પણ LLPS અને એકત્રીકરણમાંથી પસાર થઈ શકે છે (પૂરક ફિગ. 8e) .જો કે, જ્યારે Tau441 અને αS બંને હાજર હોય ત્યારે ટીપું કોલેસેન્સ, તરાપોનું નિર્માણ અને અગત્યનું, પ્રવાહી જેવા કોસર્વેટ્સની અંદર પ્રોટીન એકત્રીકરણની ડિગ્રી મહત્તમ હોય છે.
દરેક પ્રોટીનના 25 μM પર αS/Tau441 અને αS/ΔNt-Tau ની લાઇફટાઇમ ફ્લોરોસેન્સ માઇક્રોસ્કોપી (FLIM) છબીઓ (1 μM AF488-લેબલ αS અને 1 μM Atto647N-લેબલવાળી Tau441 અથવા ΔNt-Tau LLPSer buff) માં.કૉલમ વિવિધ પરિપક્વતા સમયે (30 મિનિટ, 5 કલાક અને 24 કલાક) LLPS નમૂનાઓની પ્રતિનિધિ છબીઓ દર્શાવે છે.લાલ ફ્રેમ αS/Tau441 સ્પોટ ધરાવતો પ્રદેશ દર્શાવે છે.આયુષ્ય કલર બાર તરીકે બતાવવામાં આવે છે.બધી છબીઓ માટે સ્કેલ બાર = 20 µm.b પસંદ કરેલ વિસ્તારની ઝૂમ-ઇન FLIM છબી, પેનલ a માં લાલ બોક્સમાં દર્શાવેલ છે.આયુષ્ય શ્રેણીઓ પેનલ a માં સમાન રંગ સ્કેલનો ઉપયોગ કરીને બતાવવામાં આવે છે.સ્કેલ બાર = 5 µm.c હિસ્ટોગ્રામ AF488 (αS સાથે જોડાયેલ) અથવા Atto647N (Tau સાથે જોડાયેલ) દર્શાવતા વિવિધ પ્રોટીન પ્રજાતિઓ (ડ્રોપલેટ-D-, raft-R- અને speckle-P) માટે રેકોર્ડ કરાયેલ FLIM ઈમેજોમાં ઓળખવામાં આવે છે. αS/ΔNt-Tau coacervate નમૂનાઓ (D માટે N = 17-32 ROI, R માટે 29-44 ROI, અને પોઈન્ટ માટે 21-51 ROI).સરેરાશ અને મધ્ય મૂલ્યો અનુક્રમે બોક્સની અંદર પીળા ચોરસ અને કાળી રેખાઓ તરીકે બતાવવામાં આવે છે.બૉક્સના નીચલા અને ઉપલા બાઉન્ડ્સ અનુક્રમે પ્રથમ અને ત્રીજા ચતુર્થાંશનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે, અને 1.5-ગણી ઇન્ટરક્વાર્ટાઇલ રેન્જ (IQR) ની અંદર લઘુત્તમ અને મહત્તમ મૂલ્યો વ્હિસ્કર તરીકે બતાવવામાં આવે છે.આઉટલિયર્સને કાળા હીરા તરીકે દર્શાવવામાં આવ્યા છે.અસમાન ભિન્નતા ધારીને, બે-નમૂના ટી-ટેસ્ટનો ઉપયોગ કરીને વિતરણની જોડી વચ્ચે આંકડાકીય મહત્વ નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું.બે પૂંછડીવાળા ટી-ટેસ્ટ p-મૂલ્યો તુલનાત્મક ડેટાની દરેક જોડી માટે ફૂદડી સાથે બતાવવામાં આવે છે (* p-મૂલ્ય > 0.01, ** p-મૂલ્ય > 0.001, *** p-મૂલ્ય > 0.0001, **** p-મૂલ્ય > 0.00001), ns ઉપેક્ષા સૂચવે છે (p-મૂલ્ય > 0.05).ચોક્કસ p મૂલ્યો પૂરક કોષ્ટક 1 માં આપવામાં આવ્યા છે, અને મૂળ ડેટા કાચા ડેટા ફાઇલો તરીકે રજૂ કરવામાં આવે છે.
સ્પેકલ્સ/એગ્રિગેટ્સની એમીલોઇડ-જેવી પ્રકૃતિને વધુ દર્શાવવા માટે, અમે (1 M) NaCl ની ઉચ્ચ સાંદ્રતા સાથે 24 કલાક માટે બિનજરૂરી કોસર્વેટ નમૂનાઓની સારવાર કરી, જેના પરિણામે પ્રોટીન કોસરવેટ્સમાંથી એગ્રીગેટ્સને અલગ કરવામાં આવ્યા.જ્યારે અણુ બળ માઈક્રોસ્કોપી (AFM) નો ઉપયોગ કરીને અલગ કરેલ એકત્રીકરણ (એટલે ​​​​કે, એકંદરનું વિખરાયેલું દ્રાવણ) અવલોકન કરવામાં આવ્યું હતું, ત્યારે અમે લગભગ 15 nm ની નિયમિત ઊંચાઈ સાથે મુખ્યત્વે ગોળાકાર આકારશાસ્ત્રનું અવલોકન કર્યું હતું, જે ઉચ્ચ મીઠાની સાંદ્રતાની પરિસ્થિતિઓમાં સાંકળવાનું વલણ ધરાવે છે. સપાટી પરની મજબૂત હાઇડ્રોફોબિક અસરને કારણે લાક્ષણિક એમીલોઇડ ફાઈબ્રિલ્સનું વર્તન (નોંધ કરો કે ફાઈબ્રિલ્સની ઊંચાઈ સામાન્ય રીતે ~10 એનએમ હોય છે) (પૂરક ફિગ. 10a).રસપ્રદ વાત એ છે કે, જ્યારે સ્ટાન્ડર્ડ ThT ફ્લોરોસેન્સ એસેમાં અલગ કરાયેલા એકંદરને ThT સાથે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા, ત્યારે અમે ThT ફ્લોરોસેન્સ ક્વોન્ટમ યીલ્ડમાં નાટ્યાત્મક વધારો જોયો હતો, જ્યારે રંગને લાક્ષણિક αS એમીલોઇડ ફાઇબ્રીલ્સ (પૂરક F10b) સાથે ઉકાળવામાં આવે ત્યારે જોવા મળે છે તેની સરખામણીમાં. કોસર્વેટ એગ્રીગેટ્સમાં એમીલોઇડ જેવી રચનાઓ હોય છે..વાસ્તવમાં, એગ્રીગેટ્સ ઉચ્ચ મીઠાની સાંદ્રતા માટે સહનશીલ હતા પરંતુ લાક્ષણિક એમીલોઇડ ફાઈબ્રિલ્સ (પૂરક ફિગ. 10c)ની જેમ 4 M guanidine ક્લોરાઇડ (GdnHCl) પ્રત્યે સંવેદનશીલ હતા.
આગળ, અમે સિંગલ મોલેક્યુલ ફ્લોરોસેન્સ, ચોક્કસ ફ્લોરોસેન્સ કોરિલેશન/ક્રોસ-કોરિલેશન સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી (FCS/FCCS), અને દ્વિ-રંગી સંયોગ શોધ (TCCD) ના વિસ્ફોટ વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરીને એકંદરની રચનાનું વિશ્લેષણ કર્યું.આ માટે, અમે αS અને Tau441 (બંને 25 μM) ધરાવતા 100 μl LLPS નમૂનાઓમાં 24 કલાકના સેવન પછી રચાયેલા એકંદરને 1 μM AF488-લેબલવાળા αS અને 1 μM Atto647N-લેબલવાળા Tau441 સાથે અલગ કર્યા છે.LLPS અને પ્રોટીન વચ્ચેની કોઈપણ સંભવિત ઈલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને રોકવા માટે સમાન PEG-ફ્રી બફર અને 1 M NaCl (એગ્રિગેટ્સને કોસર્વેટથી અલગ કરવા માટે વપરાયેલ સમાન બફર) નો ઉપયોગ કરીને પરિણામી વિખરાયેલા એકંદર દ્રાવણને મોનોમોલેક્યુલર સ્થિતિમાં પાતળું કરો.એક પરમાણુના સમય માર્ગનું ઉદાહરણ ફિગ. 7a માં જોઈ શકાય છે.FCCS/FCS વિશ્લેષણ (ક્રોસ-કોરિલેશન, CC અને ઓટોકોરિલેશન, AC) દર્શાવે છે કે αS અને tau ધરાવતાં એકંદર નમૂનાઓમાં વિપુલ પ્રમાણમાં હતા (ફિગ. 7b, ડાબી પેનલમાં CC વળાંક જુઓ), અને શેષ મોનોમેરિક પ્રોટીનની વધુ પડતી ઉદભવે છે. મંદન પ્રક્રિયાનું પરિણામ (આકૃતિ 7b, ડાબી પેનલમાં AC વળાંકો જુઓ).માત્ર મોનોમેરિક પ્રોટીન ધરાવતા નમૂનાઓનો ઉપયોગ કરીને સમાન સોલ્યુશનની પરિસ્થિતિઓ હેઠળ કરવામાં આવેલા નિયંત્રણ પ્રયોગોમાં કોઈ CC વણાંકો જોવા મળ્યા નથી, અને AC વણાંકો એક-ઘટક પ્રસરણ મોડેલ (Eq. 4) સાથે સારી રીતે બંધબેસે છે, જ્યાં મોનોમેરિક પ્રોટીનમાં અપેક્ષિત પ્રસરણ ગુણાંક હોય છે (ફિગ. 7b). ), જમણી પેનલ).એકીકૃત કણોનો પ્રસરણ ગુણાંક 1 µm2/s કરતાં ઓછો છે, અને મોનોમેરિક પ્રોટીનનો લગભગ 1 µm2/s છે.50-100 µm/s;મૂલ્યો સોનિકેટેડ αS amyloid fibrils અને monomeric αS માટે અલગથી સમાન ઉકેલની શરતો હેઠળ અગાઉ પ્રકાશિત મૂલ્યો સમાન છે44.જ્યારે અમે TCCD વિસ્ફોટ વિશ્લેષણ (ફિગ. 7c, ટોચની પેનલ) સાથે એકંદરનું વિશ્લેષણ કર્યું, ત્યારે અમને જાણવા મળ્યું કે દરેક અલગ કરેલ એકંદર (αS/Tau heteroaggregate), લગભગ 60% શોધાયેલ એકંદરમાં αS અને tau બંનેનો સમાવેશ થાય છે, લગભગ 30% માત્ર સમાયેલ છે. tau, લગભગ 10% αS માત્ર.αS/Tau heteroaggregates ના સ્ટોઇકિયોમેટ્રિક વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે મોટાભાગના હેટરોએગ્રિગેટ્સ ટાઉમાં સમૃદ્ધ હતા (0.5 થી નીચે stoichiometry, એકંદરે ટાઉ પરમાણુઓની સરેરાશ સંખ્યા αS પરમાણુઓ કરતાં 4 ગણી વધારે છે), જે FLIM સીટુમાં અવલોકન કરાયેલ અમારા કાર્ય સાથે સુસંગત છે. પ્રયોગો.FRET વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે આ એકંદરમાં બંને પ્રોટીન હોય છે, જો કે આ કિસ્સામાં વાસ્તવિક FRET મૂલ્યો ખૂબ મહત્વના નથી, કારણ કે પ્રયોગમાં વપરાતા લેબલ વગરના પ્રોટીનના વધારાને કારણે દરેક એકંદરમાં ફ્લોરોફોર્સનું વિતરણ રેન્ડમ હતું.રસપ્રદ વાત એ છે કે, જ્યારે અમે 45,46 પરિપક્વ એમીલોઇડ એકત્રીકરણ-ઉણપવાળા ટાઉ વેરિઅન્ટનો ઉપયોગ કરીને સમાન વિશ્લેષણ કર્યું (જુઓ પૂરક ફિગ. 11a,b), અમે નોંધ્યું કે αS ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક એકત્રીકરણ સમાન હતું (પૂરક ફિગ. 11c, d), કોસરવેટની અંદર એગ્રીગેટ્સ બનાવવાની ક્ષમતામાં ભારે ઘટાડો થયો હતો અને FLIM એ સીટુ પ્રયોગોમાં ઘણા સ્થળો શોધી કાઢ્યા હતા, અને અલગ થયેલા એકંદર નમૂનાઓ માટે નબળા ક્રોસ-સંબંધ વણાંકો જોવા મળ્યા હતા.જો કે, શોધાયેલ એકંદરની નાની સંખ્યા માટે (Tau441નો માત્ર દસમો ભાગ), અમે અવલોકન કર્યું છે કે દરેક એકંદર આ Tau ચલ કરતાં αS માં સમૃદ્ધ હતું, લગભગ 50% શોધાયેલ એકંદર માત્ર αS પરમાણુઓ ધરાવે છે, અને αS વધુ પડતા વિજાતીય હતા. .Tau441 (ફિગ. 6f) દ્વારા જનરેટ કરાયેલ વિજાતીય એકંદરથી વિપરીત (પૂરક ફિગ. 11e જુઓ).આ પ્રયોગોના પરિણામો દર્શાવે છે કે αS પોતે કોસરવેટની અંદર ટાઉ સાથે સંચય કરવામાં સક્ષમ હોવા છતાં, આ પરિસ્થિતિઓમાં ટાઉ ન્યુક્લિએશન વધુ અનુકૂળ છે, અને પરિણામી એમીલોઇડ-જેવા એગ્રીગેટ્સ αS અને tau ના સ્વરૂપ તરીકે કાર્ય કરવા સક્ષમ છે.જો કે, એકવાર ટાઉ-સમૃદ્ધ કોર રચાય છે, αS અને tau વચ્ચેની વિષમતાપૂર્ણ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ ટાઉ પરમાણુઓ વચ્ચેની હોમોટાઇપિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ પર એકંદરે તરફેણ કરે છે;અમે પ્રવાહી αS/tau coacervates માં પણ પ્રોટીન નેટવર્કનું અવલોકન કરીએ છીએ.
αS/Tau441 ઈલેક્ટ્રોસ્ટેટિક કોસેર્વેટ્સમાં બનેલા એકલ અણુઓના એકલ પરમાણુઓના પ્રતિનિધિ ફ્લોરોસેન્સ ટેમ્પોરલ ટ્રેસ.αS/Tau441 કોએગ્રિગેટ્સને અનુરૂપ વિસ્ફોટો (નિર્દેશિત થ્રેશોલ્ડની ઉપરના વિસ્ફોટો) ત્રણ ડિટેક્શન ચેનલોમાં જોવા મળ્યા હતા (એએફ488 અને એટો647એન પ્રત્યક્ષ ઉત્તેજના પછી ઉત્સર્જન, વાદળી અને લાલ રેખાઓ, પરોક્ષ ઉત્તેજના પછી એટો647એન ઉત્સર્જન), FRET, વાયોલેટ લાઇન).b LLPS (ડાબી પેનલ) માંથી મેળવેલ અલગ αS/Tau441 એગ્રીગેટ્સના નમૂનાનું FCS/FCCS વિશ્લેષણ.AF488 અને Atto647N માટે સ્વતઃસંબંધ (AC) વણાંકો અનુક્રમે વાદળી અને લાલ રંગમાં દર્શાવવામાં આવ્યા છે, અને બંને રંગો ધરાવતા એકંદર સાથે સંકળાયેલ ક્રોસ-કોરિલેશન (CC) વણાંકો જાંબલી રંગમાં દર્શાવવામાં આવ્યા છે.AC વણાંકો લેબલવાળી મોનોમેરિક અને એકંદર પ્રોટીન પ્રજાતિઓની હાજરીને પ્રતિબિંબિત કરે છે, જ્યારે CC વણાંકો માત્ર ડબલ-લેબલવાળા એગ્રીગેટ્સનો ફેલાવો દર્શાવે છે.સમાન પૃથ્થકરણ, પરંતુ અલગ-અલગ સ્થળોની જેમ જ ઉકેલની સ્થિતિમાં, માત્ર મોનોમેરિક αS અને Tau441 ધરાવતા નમૂનાઓ જમણી પેનલમાં નિયંત્રણો તરીકે બતાવવામાં આવે છે.c αS/Tau441 ઈલેક્ટ્રોસ્ટેટિક કોસેર્વેટ્સમાં રચાયેલા એકલ અણુઓનું ફ્લોરોસેન્સ ફ્લેશ વિશ્લેષણ.ચાર અલગ-અલગ રિપીટ (N = 152)માં મળેલ દરેક એકંદર માટેની માહિતી તેમની સ્ટોઇકોમેટ્રી, S મૂલ્યો અને FRET કાર્યક્ષમતા (ટોચની પેનલ, રંગ પટ્ટી ઘટનાને પ્રતિબિંબિત કરે છે) સામે રચવામાં આવી છે.ત્રણ પ્રકારના એગ્રીગેટ્સને ઓળખી શકાય છે: S~1 અને FRET~0 સાથે માત્ર αS-એગ્રિગેટ્સ, S~0 અને FRET~1 સાથે માત્ર Tau-એગ્રિગેટ્સ અને મધ્યવર્તી S સાથે વિજાતીય Tau/αS એગ્રીગેટ્સ અને રકમના FRET અંદાજો દરેક વિજાતીય એકંદર (N = 100) માં શોધાયેલ બંને માર્કર પ્રોટીન નીચલા પેનલમાં બતાવવામાં આવે છે (રંગ સ્કેલ ઘટનાને પ્રતિબિંબિત કરે છે).કાચો ડેટા કાચા ડેટા ફાઇલોના સ્વરૂપમાં પ્રદાન કરવામાં આવે છે.
પ્રવાહી પ્રોટીનની પરિપક્વતા અથવા વૃદ્ધત્વ સમયાંતરે જેલ જેવી અથવા નક્કર રચનામાં ઘનીકરણ થાય છે તે કન્ડેન્સેટ47ના કેટલાક શારીરિક કાર્યોમાં તેમજ રોગમાં સામેલ હોવાનું નોંધવામાં આવ્યું છે, એમીલોઇડ એકત્રીકરણ 7, 48, 49 પહેલાની અસામાન્ય પ્રક્રિયા તરીકે. અહીં અમે તબક્કાના વિભાજન અને વર્તનનો વિગતવાર અભ્યાસ કરીએ છીએ.ઓછી માઇક્રોમોલર સાંદ્રતા અને શારીરિક રીતે સંબંધિત પરિસ્થિતિઓમાં નિયંત્રિત વાતાવરણમાં રેન્ડમ પોલિકેશનની હાજરીમાં LSPT αS (નોંધ કરો કે αS ની ગણતરી કરેલ શારીરિક સાંદ્રતા >1 µM50 છે), LPS ના લાક્ષણિક થર્મોડાયનેમિકલી સંચાલિત વર્તનને અનુસરીને.અમે શોધી કાઢ્યું કે αS, જેમાં શારીરિક pH પર અત્યંત નકારાત્મક રીતે ચાર્જ થયેલ C-ટર્મિનલ પ્રદેશ છે, તે ઇલેકટ્રોસ્ટેટિક પ્રક્રિયા દ્વારા pLK અથવા Tau જેવા અત્યંત cationic અવ્યવસ્થિત પેપ્ટાઇડ્સની હાજરીમાં LLPS દ્વારા જલીય દ્રાવણમાં પ્રોટીન-સમૃદ્ધ ટીપું રચવામાં સક્ષમ છે. એકત્રીકરણ મેક્રોમોલેક્યુલ્સની હાજરીમાં જટિલ ઘનીકરણ.આ પ્રક્રિયાની સેલ્યુલર વાતાવરણમાં સંબંધિત અસરો હોઈ શકે છે જ્યાં αS વિટ્રો અને vivo51,52,53,54 બંનેમાં તેના રોગ-સંબંધિત એકત્રીકરણ સાથે સંકળાયેલ વિવિધ પોલિકેશનિક પરમાણુઓનો સામનો કરે છે.
ઘણા અભ્યાસોમાં, ટીપાંની અંદર પ્રોટીનની ગતિશીલતાને પરિપક્વતા પ્રક્રિયા55,56 નક્કી કરતા મુખ્ય પરિબળોમાંના એક તરીકે ગણવામાં આવે છે.ઈલેક્ટ્રોસ્ટેટિક αS માં પોલિકેશન્સ સાથે કોસર્વેટ થાય છે, પરિપક્વતા પ્રક્રિયા દેખીતી રીતે પોલિકેશન્સ સાથેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓની શક્તિ, સંયોજકતા અને આ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓની બહુવિધતા પર આધાર રાખે છે.સંતુલન સિદ્ધાંત સૂચવે છે કે બે પ્રવાહી અવસ્થાઓનું સંતુલન લેન્ડસ્કેપ LLPS57,58 ચલાવતા બાયોપોલિમર્સથી સમૃદ્ધ મોટા ટીપુંની હાજરી હશે.ઓસ્ટવાલ્ડ પરિપક્વતા59, કોલેસેન્સ60 અથવા વિખેરાયેલા તબક્કા61માં મુક્ત મોનોમરના વપરાશ દ્વારા ટીપાંની વૃદ્ધિ પ્રાપ્ત કરી શકાય છે.αS અને Tau441, ΔNt-Tau અથવા pLK માટે, મોટાભાગના પ્રોટીન આ અભ્યાસમાં ઉપયોગમાં લેવાતી શરતો હેઠળ કન્ડેન્સેટમાં કેન્દ્રિત હતા.જો કે, જ્યારે સપાટી ભીના થવા પર પૂર્ણ-કદના ટાઉના ટીપાં ઝડપથી ભેગા થાય છે, ત્યારે ટીપું એકીકરણ અને ભીનાશ ΔNt-Tau અને pLK માટે મુશ્કેલ હતા, જે આ બે પ્રણાલીઓમાં પ્રવાહી ગુણધર્મોના ઝડપી નુકશાનનું સૂચન કરે છે.અમારા FLIM-FRET પૃથ્થકરણ મુજબ, વૃદ્ધ pLK અને ΔNt-Tau ટીપાંએ મૂળ ટીપાંની જેમ પ્રોટીન એકત્રીકરણની સમાન ડિગ્રી (સમાન ફ્લોરોસેન્સ લાઇફટાઇમ) દર્શાવ્યું હતું, જે સૂચવે છે કે મૂળ પ્રોટીન નેટવર્ક જાળવી રાખવામાં આવ્યું હતું, જોકે વધુ કઠોર છે.
અમે નીચેના મોડેલમાં અમારા પ્રાયોગિક પરિણામોને તર્કસંગત બનાવીએ છીએ (આકૃતિ 8).શરૂઆતમાં અસ્થાયી રૂપે રચાયેલ ટીપું ઘણીવાર ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક વળતર વિના પ્રોટીન નેટવર્ક હોય છે, અને આમ ચાર્જ અસંતુલનના ક્ષેત્રો હોય છે, ખાસ કરીને ટીપું ઇન્ટરફેસ પર, જેના પરિણામે ઉચ્ચ ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક સપાટીની સંભવિતતાવાળા ટીપાં થાય છે.ચાર્જની ભરપાઈ કરવા (એક ઘટના જેને સામાન્ય રીતે સંયોજક અવક્ષય તરીકે ઓળખવામાં આવે છે) અને ટીપાંની સપાટીની સંભવિતતાને ઘટાડવા માટે, ટીપું પાતળું તબક્કામાંથી નવા પોલીપેપ્ટાઈડ્સનો સમાવેશ કરી શકે છે, ચાર્જ-ચાર્જ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને ઑપ્ટિમાઇઝ કરવા માટે પ્રોટીન નેટવર્કનું પુનર્ગઠન કરી શકે છે અને અન્ય ટીપાઓ સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરી શકે છે.સપાટીઓ સાથે (ભીનાશ).αS/pLK ટીપું, તેમના સરળ પ્રોટીન નેટવર્ક (માત્ર αS અને pLK વચ્ચેની વિષમતાપૂર્ણ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ) અને પ્રોટીન-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ માટે વધુ આકર્ષણને કારણે, કન્ડેન્સેટના ચાર્જને વધુ ઝડપથી સંતુલિત કરવામાં સક્ષમ જણાય છે;ખરેખર, અમે αS/Tau કરતાં શરૂઆતમાં રચાયેલા αS/pLK કોસેર્વેટ્સમાં ઝડપી પ્રોટીન ગતિશાસ્ત્રનું અવલોકન કર્યું.સંયોજક અવક્ષય પછી, ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ ઓછી ક્ષણિક બની જાય છે અને ટીપું તેમના પ્રવાહી ગુણધર્મો ગુમાવે છે અને ઓછી ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક સપાટીની સંભવિતતા (અને તેથી સપાટીને ભીની કરવામાં અસમર્થ) સાથે જેલ જેવા, બિન-જ્વલનશીલ ટીપાંમાં ફેરવાય છે.તેનાથી વિપરિત, વધુ જટિલ પ્રોટીન નેટવર્ક્સ (હોમોટાઇપિક અને હેટરોટાઇપિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ બંને સાથે) અને પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓની નબળી પ્રકૃતિને કારણે αS/Tau ટીપું ટીપું ચાર્જ સંતુલન ઑપ્ટિમાઇઝ કરવામાં ઓછા કાર્યક્ષમ છે.આનાથી ટીપાંમાં પરિણમે છે જે લાંબા સમય સુધી પ્રવાહી વર્તણૂક જાળવી રાખે છે અને ઉચ્ચ ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક સપાટીની સંભવિતતા દર્શાવે છે જે કોલેસિંગ અને વધવા દ્વારા ઘટાડવામાં આવે છે (આમ ટીપુંનો સપાટી વિસ્તાર/વોલ્યુમ ગુણોત્તર ઘટાડીને) અને હાઇડ્રોફિલિક સપાટી રસાયણને ભીના કરીને.આ મોટી સંકેન્દ્રિત પ્રોટીન લાઇબ્રેરીઓ બનાવે છે જે પ્રવાહી ગુણધર્મો જાળવી રાખે છે કારણ કે પ્રોટીન નેટવર્કમાં ચાર્જ ઑપ્ટિમાઇઝેશન માટે સતત શોધને કારણે ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ ખૂબ જ ક્ષણિક રહે છે.રસપ્રદ વાત એ છે કે, ટાઉના એન-ટર્મિનલી કપાયેલા સ્વરૂપો, જેમાં કેટલાક કુદરતી રીતે બનતા આઇસોફોર્મ 62નો સમાવેશ થાય છે, મધ્યવર્તી વર્તણૂક પ્રદર્શિત કરે છે, જેમાં αS સાથે વૃદ્ધત્વ લાંબા સમય સુધી જીવતા જેલ-જેવા ટીપું બને છે, જ્યારે અન્ય મોટા પ્રવાહી કન્ડેન્સેટમાં પરિવર્તિત થાય છે.αS ઈલેક્ટ્રોસ્ટેટિક કોસર્વેટ્સની પરિપક્વતામાં આ દ્વૈતતા તાજેતરના LLPS સૈદ્ધાંતિક અને પ્રાયોગિક અભ્યાસો સાથે સુસંગત છે જેણે કન્ડેન્સેટના કદ અને પ્રવાહી ગુણધર્મોને નિયંત્રિત કરવાની ચાવી તરીકે કન્ડેન્સેટમાં વેલેન્સ ડિપ્લેશન અને ઈલેક્ટ્રોસ્ટેટિક સીવિંગ વચ્ચેનો સંબંધ ઓળખ્યો છે.મિકેનિઝમ 58.61.
આ યોજના એલએલપીએસ અને એલએસપીટી દ્વારા αS અને Tau441 માટે પુટેટિવ ​​એમીલોઇડ એકત્રીકરણ માર્ગ બતાવે છે.વધારાના આયન-સમૃદ્ધ (લાલ) અને કેશન-સમૃદ્ધ (વાદળી) પ્રદેશો સાથે, સંતોષકારક સંયોજકતા સાથે αS અને ટાઉ ઈલેક્ટ્રોસ્ટેટિક કોસેર્વેટ્સમાં સપાટીની ઉર્જા ઓછી હોય છે અને તેથી ઓછી સંકલન થાય છે, જેના પરિણામે ટીપું ઝડપથી વૃદ્ધ થાય છે.સ્થિર નોન-એગ્ગ્લોમેરેટેડ જેલ સ્થિતિ પ્રાપ્ત થાય છે..આ સ્થિતિ αS/pLK સિસ્ટમના કિસ્સામાં તેના ઉચ્ચ આકર્ષણ અને સરળ પ્રોટીન-જોડી ક્રિયાપ્રતિક્રિયા નેટવર્કને કારણે ખૂબ અનુકૂળ છે, જે ઝડપી જેલ જેવા સંક્રમણ માટે પરવાનગી આપે છે.તેનાથી વિપરિત, અસંતોષકારક સંયોજકતા સાથેના ટીપાં અને તેથી, ક્રિયાપ્રતિક્રિયા માટે ઉપલબ્ધ પ્રોટીન-ચાર્જ્ડ પ્રદેશો, કોસેર્વેટને તેની ઉચ્ચ સપાટીની ઊર્જા ઘટાડવા માટે હાઇડ્રોફિલિક સપાટીને ફ્યુઝ અને ભીની કરવાનું સરળ બનાવે છે.આ સ્થિતિ αS/Tau441 coacervates માટે પ્રાધાન્યક્ષમ છે, જેઓ નબળા Tau-Tau અને αS-Tau ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ ધરાવતાં બહુસંયોજક જટિલ નેટવર્ક ધરાવે છે.બદલામાં, મોટા કોસર્વેટ વધુ સરળતાથી તેમના પ્રવાહી જેવા ગુણધર્મો જાળવી રાખશે, જે અન્ય પ્રોટીન-થી-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ થવા દે છે.આખરે, કોસર્વેટ પ્રવાહીમાં αS અને tau બંને ધરાવતા એમીલોઇડ વિજાતીય એકત્રીકરણ, જે સમાવિષ્ટ સંસ્થાઓમાં જોવા મળતા લોકો સાથે સંબંધિત હોઈ શકે છે, જે ન્યુરોડિજનરેટિવ રોગોના લક્ષણો છે.
αS/Tau441 ની પરિપક્વતા દરમિયાન અત્યંત ગીચ પરંતુ ગતિશીલ પ્રોટીન વાતાવરણ સાથે રચાયેલી મોટી પ્રવાહી જેવી રચનાઓ અને થોડા અંશે, αS/ΔNt-Tau coacervates એ પ્રોટીન એકત્રીકરણના ન્યુક્લિયેશન માટે આદર્શ જળાશયો છે.અમે ખરેખર આ પ્રકારના પ્રોટીન કોસેર્વેટ્સમાં ઘન પ્રોટીન એકત્રીકરણની રચનાનું અવલોકન કર્યું છે, જેમાં ઘણીવાર αS અને tau બંને હોય છે.અમે બતાવ્યું છે કે આ હેટરોએગ્રિગેટ્સ બિન-ઈલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ દ્વારા સ્થિર થાય છે, સામાન્ય એમાઈલોઈડ ફાઈબ્રિલ્સની જેમ જ એમીલોઈડ-વિશિષ્ટ ThT રંગોને બાંધવામાં સક્ષમ હોય છે, અને ખરેખર વિવિધ પ્રભાવો માટે સમાન પ્રતિકાર ધરાવે છે.LLPS દ્વારા રચાયેલ αS/tau એગ્રીગેટ્સમાં એમીલોઇડ જેવા ગુણધર્મો હોવાનું દર્શાવવામાં આવ્યું હતું.ખરેખર, પ્રવાહી ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક કોસરવેટની અંદર આ વિજાતીય αS એકત્રીકરણની રચનામાં amyloid એકત્રીકરણમાં Tau ની ઉણપનો પરિપક્વ પ્રકાર નોંધપાત્ર રીતે ક્ષતિગ્રસ્ત છે.αS/Tau441 એગ્રીગેટ્સની રચના માત્ર કોસરવેટ્સની અંદર જ જોવા મળી હતી, જે પ્રવાહી જેવા ગુણધર્મો જાળવી રાખે છે, અને જો કોસેર્વેટ/ટીપું જેલની સ્થિતિમાં ન પહોંચે તો ક્યારેય નહીં.પછીના કિસ્સામાં, ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓની વધેલી તાકાત અને પરિણામે, પ્રોટીન નેટવર્કની કઠોરતા એમિલોઇડ ન્યુક્લિએશન માટે જરૂરી નવી પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ સ્થાપિત કરવા માટે પ્રોટીનની જરૂરી રચનાત્મક પુન: ગોઠવણીને અટકાવે છે.જો કે, આ વધુ લવચીક, પ્રવાહી જેવા કોસર્વેટ્સમાં પ્રાપ્ત કરી શકાય છે, જે બદલામાં કદમાં વધારો થતાં પ્રવાહી રહેવાની શક્યતા વધારે છે.
હકીકત એ છે કે કન્ડેન્સ્ડ તબક્કાની અંદર એકત્રીકરણનું નિર્માણ નાના ટીપાં કરતાં મોટા αS/Tau કન્ડેન્સેટમાં પ્રાધાન્યક્ષમ છે જે ઝડપથી જેલ કરે છે, તે પરિબળોને ઓળખવાની સુસંગતતાને પ્રકાશિત કરે છે જે ટીપું એકીકરણને નિયંત્રિત કરે છે.આમ, માત્ર તબક્કાને અલગ કરવાની વૃત્તિ જ નથી, પરંતુ યોગ્ય કામગીરી તેમજ રોગ નિવારણ માટે કન્ડેન્સેટનું કદ નિયંત્રિત હોવું જોઈએ58,61.અમારા પરિણામો αS/Tau સિસ્ટમ માટે LLPS અને LSPT વચ્ચેના સંતુલનના મહત્વને પણ પ્રકાશિત કરે છે.જ્યારે ટીપું રચના સંતૃપ્તિની સ્થિતિમાં ઉપલબ્ધ પ્રોટીન મોનોમર્સની માત્રાને ઘટાડીને એમીલોઇડ એકત્રીકરણ સામે રક્ષણ આપી શકે છે, જેમ કે અન્ય સિસ્ટમો63,64માં સૂચિત કરવામાં આવ્યું છે, ઉચ્ચ ટીપું સ્તર પર ટીપું ફ્યુઝન ધીમી રચનાત્મક પુનઃ ગોઠવણી દ્વારા આંતરિક પ્રોટીન એકત્રીકરણ તરફ દોરી શકે છે.પ્રોટીન નેટવર્ક..
એકંદરે, અમારો ડેટા LSPT ના સંદર્ભમાં ડ્રોપ નેટવર્ક્સમાં સુસંગત સંયોજકતા અને સંતુષ્ટ/અસંતોષિત ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓની સુસંગતતા પર ભારપૂર્વક ભાર મૂકે છે.ખાસ કરીને, અમે બતાવીએ છીએ કે પૂર્ણ-લંબાઈના αS/Tau441 કન્ડેન્સેટ અસરકારક રીતે ફ્યુઝ અને ન્યુક્લિએટ કરવા માટે સક્ષમ છે એમાયલોઇડ જેવા હેટરોએગ્રિગેટ્સ કે જેમાં પ્રોટીન બંનેનો સમાવેશ થાય છે અને અમારા પ્રાયોગિક પરિણામોના આધારે એક પરમાણુ મિકેનિઝમ પ્રસ્તાવિત કરે છે.αS/Tau પ્રવાહી કોસરવેટમાં બે પ્રોટીનનું સહ-એકત્રીકરણ કે જે અમે અહીં જાણ કરીએ છીએ તે ખરેખર સમાવેશમાં બે પ્રોટીનના સહ-સ્થાનિકીકરણ સાથે સંબંધિત હોઈ શકે છે, જે રોગના લક્ષણો છે, અને LLPS અને વચ્ચેના સંબંધને સમજવામાં યોગદાન આપી શકે છે. એમીલોઇડ એકત્રીકરણ, ન્યુરોડિજનરેશનમાં અત્યંત ચાર્જ થયેલ IDP માટે માર્ગ મોકળો કરે છે.
મોનોમેરિક WT-αS, સિસ્ટીન મ્યુટન્ટ્સ (Q24C-αS, N122C-αS) અને ΔCt-αS વેરિઅન્ટ્સ (Δ101-140) E. coli માં વ્યક્ત કરવામાં આવ્યા હતા અને અગાઉ વર્ણવ્યા પ્રમાણે શુદ્ધ કરવામાં આવ્યા હતા.ડાયસલ્ફાઇડ બોન્ડની રચનાને રોકવા માટે αS સિસ્ટીન મ્યુટન્ટ્સના શુદ્ધિકરણના તમામ પગલાઓમાં 5 mM DTTનો સમાવેશ કરવામાં આવ્યો હતો.Tau441 isoform (Addgene #16316 માંથી મેળવેલ પ્લાઝમિડ), ΔNt-Tau ચલ (Δ1–150, પ્રાઇમર્સ સાથે IVA નું ક્લોનિંગ કરીને મેળવવામાં આવે છે CTTTAAGAAGGAGAGAATACATGATCGCCCACCGCGG, CATATGTATCCTCTCTTCTTATAAGTTAA53,ΔTAAGTTAA53) GGCTC5 પ્રાઈમર સાથે) ઇ. કોલી સંસ્કૃતિઓ હતી 37°C અને 180 rpm પર OD600 = 0.6–0.7 સુધી વધ્યું અને 37°C પર 3 કલાક માટે IPTG સાથે અભિવ્યક્તિ પ્રેરિત કરવામાં આવી.4 °C તાપમાને 15 મિનિટ માટે 11,500 xg પર કોષોની કાપણી કરો અને 150 mM NaCl ધરાવતા ખારા બફરથી ધોઈ લો.લિસિસ બફર (20 મિલી પ્રતિ 1 L LB: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine, 50 μpe μ0ptinM) માં પેલેટને ફરીથી મોકલો.સોનિકેશન સ્ટેપ બરફ પર 10 કઠોળ માટે 80% ના કંપનવિસ્તાર સાથે કરવામાં આવ્યું હતું (1 મિનિટ ચાલુ, 1 મિનિટ બંધ).એક અલ્ટ્રાસાઉન્ડમાં 60 મિલીથી વધુ નહીં.E. coli lysates ને 95° C. પર 20 મિનિટ માટે ગરમ કરવામાં આવે છે, પછી બરફ પર ઠંડુ કરવામાં આવે છે અને 40 મિનિટ માટે 127,000×g પર સેન્ટ્રીફ્યુઝ કરવામાં આવે છે.સ્પષ્ટ થયેલ સુપરનેટન્ટ 3.5 kDa મેમ્બ્રેન (સ્પેક્ટ્રમ™ થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, યુકે) પર લાગુ કરવામાં આવ્યું હતું અને ડાયાલિસિસ બફરના 4 L (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 mTT, D22 mM) સામે ડાયલાઇઝ કરવામાં આવ્યું હતું. , PMSF 0.1 એમએમ) 10 કલાક માટે.5 મિલી કેશન એક્સચેન્જ કૉલમ (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) સંતુલન બફર (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, PFMS) સાથે સંતુલિત કરવામાં આવ્યું હતું.ટાઉ લિસેટને 0.22 μm PVDF ફિલ્ટર દ્વારા ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યું હતું અને 1 ml/min ના પ્રવાહ દરે કૉલમમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યું હતું.ઇલ્યુશન ધીમે ધીમે હાથ ધરવામાં આવ્યું હતું, ટાઉને 15-30% ઇલ્યુશન બફર (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF) સાથે એલ્યુટ કરવામાં આવ્યું હતું.SDS-PAGE દ્વારા અપૂર્ણાંકોનું પૃથ્થકરણ કરવામાં આવ્યું હતું, અને ટાઉના અપેક્ષિત પરમાણુ વજન સાથે એક બેન્ડ ધરાવતા કોઈપણ અપૂર્ણાંકને 10 kDa સેન્ટ્રીફ્યુજ ફિલ્ટરનો ઉપયોગ કરીને કેન્દ્રિત કરવામાં આવ્યા હતા અને 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM અને DTT m2 માટે બફર સાથે બદલવામાં આવ્યા હતા. અંતિમ પ્રોટીન સાંદ્રતા 100 μM હતી.ત્યારબાદ પ્રોટીન સોલ્યુશનને 0.22 μm PVDF ફિલ્ટરમાંથી પસાર કરવામાં આવ્યું, ઝડપથી સ્થિર થઈ ગયું અને -80 °C પર સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યું.પ્રો. આલ્બર્ટો બોફી દ્વારા પ્રોટિન K18 કૃપા કરીને પ્રદાન કરવામાં આવ્યું હતું.SDS-PAGE અને MALDI-TOF/TOF દ્વારા પુષ્ટિ કર્યા મુજબ તૈયારીની શુદ્ધતા >95% હતી.વિવિધ સિસ્ટીનને રાસાયણિક રીતે એલેક્સાફ્લુર488-મેલીમાઇડ (એએફ488, થર્મોફિશર સાયન્ટિફિક, વોલ્થમ, એમએ, યુએસએ) અથવા TEMPOL-મેલીમાઇડ (ટોરોન્ટો રિસર્ચ કેમિકલ્સ, ટોરોન્ટો, કેનેડા) સાથે લેબલ કરવામાં આવ્યા હતા.શોષણ અને માલડી-ટોફ/ટોફ દ્વારા પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau અને K18 એ જ પ્રક્રિયાને અનુસરીને Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany) નો ઉપયોગ કરીને 191 અને 322 સ્થાનો પર મૂળ સિસ્ટીન અવશેષો સાથે લેબલ કરવામાં આવ્યા હતા.CIDER66 નો ઉપયોગ કરીને αS અને Tau441 માટે અવશેષ નકશા દીઠ ચોખ્ખો ચાર્જ જનરેટ કરવામાં આવ્યો હતો.
સોલિડ પોલી-એલ-લાયસિન (સપ્લાયર, અલામાન્ડા પોલિમર્સ ઇન્ક, હન્ટ્સવિલે, અલાબામા, યુએસએ તરફથી NMR અનુસાર pLK DP 90-110) 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 થી 10 mM સાંદ્રતામાં ઓગળવામાં આવ્યું હતું, પ્રક્રિયા માટે સોનિકેટેડ. અલ્ટ્રાસોનિક પાણીના સ્નાનમાં મિનિટો અને -20 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર સ્ટોર કરો.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) અને FITC-dextran-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, USA) પાણીમાં દ્રાવ્ય છે અને LLPS બફરમાં વ્યાપકપણે વિતરિત થાય છે.ડાયાલિસિસ દૂષિત ક્ષાર દૂર કરે છે.ત્યારબાદ તેમને 0.22 μm ના છિદ્ર કદ સાથે સિરીંજ ફિલ્ટર દ્વારા ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યા હતા, અને તેમની સાંદ્રતાની ગણતરી રિફ્રેક્ટોમીટર (મેટલર ટોલેડો, કોલંબસ, ઓહિયો, યુએસએ) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી.LLPS નમૂનાઓ નીચેના ક્રમમાં ઓરડાના તાપમાને તૈયાર કરવામાં આવ્યા હતા: બફર અને એક્સટ્રુઝન મિશ્રિત કરવામાં આવ્યા હતા અને 1 એમએમ ટ્રિસ (2-કાર્બોક્સિથાઈલ) ફોસ્ફાઈન (TCEP, કાર્બોસિન્થ, કોમ્પટન, યુકે), 1 એમએમ 2,2,2,2- (ઇથેન- 1, 2-diyldinitrile) tetraacetic acid (EDTA, carboxynth) અને 1% પ્રોટીઝ અવરોધકનું મિશ્રણ (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM).પછી αS અને ફ્યુઝ્ડ પોલિકેશન (વિકલ્પો pLK અથવા Tau) ઉમેરવામાં આવે છે.થિયોફ્લેવિન-ટી સમય શ્રેણીના પ્રયોગો (ThT, Carbosynth, Compton, UK) માટે, કુલ ThT સાંદ્રતાનો ઉપયોગ αS સાંદ્રતા કરતાં અડધો હોવો જોઈએ.નમૂનાઓ એકરૂપ છે તેની ખાતરી કરવા માટે ધીમેધીમે પરંતુ સારી રીતે મિશ્રણ કરો.પરિણામો વિભાગમાં વર્ણવ્યા મુજબ, દરેક ઘટકની સાંદ્રતા પ્રયોગથી પ્રયોગમાં બદલાય છે.જ્યારે પણ પ્રયોગનો સમયગાળો 4 કલાકથી વધી જાય ત્યારે Azide નો ઉપયોગ 0.02% (w/v) ની સાંદ્રતા પર કરવામાં આવ્યો હતો.LLPS નમૂનાઓનો ઉપયોગ કરીને તમામ વિશ્લેષણો માટે, વિશ્લેષણની 5 મિનિટ પહેલાં મિશ્રણને સંતુલિત થવા દો.પ્રકાશ સ્કેટરિંગ વિશ્લેષણ માટે, 150 µl નમૂનાઓ બિન-બંધનકર્તા 96-વેલ માઇક્રોપ્લેટ્સ (µClear®, બ્લેક, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) પર લોડ કરવામાં આવ્યા હતા અને એડહેસિવ ફિલ્મથી આવરી લેવામાં આવ્યા હતા.CLARIOstar પ્લેટ રીડર (BMG Labtech, Ortenberg, Germany) માં સોલ્યુશનના કેન્દ્રમાં 350 nm પર શોષકતા માપવા દ્વારા LLPsનું નિરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું.પ્રયોગો 25°C પર ત્રિપુટીમાં હાથ ધરવામાં આવ્યા હતા, અને ભૂલોની ગણતરી સરેરાશથી પ્રમાણભૂત વિચલન તરીકે કરવામાં આવી હતી.પાતળું તબક્કો નમૂના સેન્ટ્રીફ્યુગેશન અને SDS-PAGE જેલ વિશ્લેષણ દ્વારા પરિમાણિત કરવામાં આવ્યો હતો, અને વિવિધ LLPS સોલ્યુશન્સમાં પાતળું અને કેન્દ્રિત તબક્કાઓમાં αS અપૂર્ણાંકની માત્રા નક્કી કરવામાં આવી હતી.100 μl LLPS નમૂના જેમાં 1 μM AF488-લેબલ αS હોય છે તે સંપૂર્ણ મિશ્રણ દ્વારા તૈયાર કરવામાં આવ્યું હતું અને ત્યારબાદ 30 મિનિટ માટે 9600×g પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન કરવામાં આવ્યું હતું, જે પછી અવક્ષેપ સામાન્ય રીતે દેખાતો હતો.SDS-PAGE જેલનો ઉપયોગ કરીને પ્રોટીનની માત્રા નક્કી કરવા માટે સુપરનેટન્ટના ટોચના 50 μlનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.ChemiDoc જેલ ઇમેજિંગ સિસ્ટમ (બાયો-રેડ લેબોરેટરીઝ, હર્ક્યુલસ, CA, USA) નો ઉપયોગ કરીને AF488 ફિલ્ટર્સ સાથે જેલ્સ સ્કેન કરવામાં આવ્યા હતા અથવા Coomassie સ્ટેનથી સ્ટેન કરવામાં આવ્યા હતા અને યોગ્ય ફિલ્ટર્સ સાથે વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવામાં આવ્યા હતા.પરિણામી બેન્ડ્સનું ઈમેજજે વર્ઝન 1.53i (નેશનલ ઈન્સ્ટીટ્યુટ ઓફ હેલ્થ, યુએસએ) નો ઉપયોગ કરીને વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.પ્રયોગો સમાન પરિણામો સાથે બે જુદા જુદા પ્રયોગોમાં ડુપ્લિકેટમાં હાથ ધરવામાં આવ્યા હતા.
સામાન્ય રીતે, 150 μl નમૂનાઓ બિન-બંધનકર્તા 96-વેલ માઇક્રોપ્લેટ પર લાગુ કરવામાં આવ્યા હતા અને લેઇકા DMI6000B ઇન્વર્ટેડ માઇક્રોસ્કોપ (લેઇકા માઇક્રોસિસ્ટમ્સ, વેટ્ઝલર, જર્મની) પર ઓરડાના તાપમાને વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવામાં આવ્યા હતા.સ્પોટ પ્રયોગો માટે, µ-સ્લાઈડ એન્જીયોજેનેસિસ પ્લેટ્સ (Ibidi GmbH, Gräfelfing, જર્મની) અથવા 96-વેલ પોલિસ્ટરીન માઇક્રોપ્લેટ્સ (કોર્નિંગ કોસ્ટાર કોર્પો., એક્ટન, મેસેચ્યુસેટ્સ) નો પણ ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.EL6000 હેલોજન અથવા મર્ક્યુરી મેટલ હલાઇડ લેમ્પનો ઉપયોગ પ્રકાશના સ્ત્રોત તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો (અનુક્રમે BF/DIC અને WF ઇમેજિંગ માટે).WF માઈક્રોસ્કોપી માટે, 40x મેગ્નિફિકેશન એર ઉદ્દેશ્ય (Leica Microsystems, Germany) નો ઉપયોગ નમૂના પર પ્રકાશને કેન્દ્રિત કરવા અને તેને એકત્રિત કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.AF488 અને ThT લેબલવાળા નમૂનાઓ માટે, પ્રમાણભૂત GFP ફિલ્ટર સેટ સાથે ઉત્તેજના અને ઉત્સર્જન ફિલ્ટર કરો, ઉત્તેજના અને ઉત્સર્જન બેન્ડપાસ ફિલ્ટર્સ, અનુક્રમે 460–500 nm અને 512–542 nm બેન્ડપાસ ફિલ્ટર્સ, અને 495 nm dichro.Atto647N સાથે લેબલવાળા નમૂનાઓ માટે, ઉત્તેજના અને ઉત્સર્જન બેન્ડપાસ ફિલ્ટર્સ સાથે અનુક્રમે 628–40 nm અને 692–40 nm, અને 660 nm ડિક્રોઈક મિરર સાથે Cy5 ફિલ્ટર્સનો પ્રમાણભૂત સમૂહનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.BF અને DIC માઇક્રોસ્કોપી માટે, સમાન પ્રતિબિંબિત પ્રકાશ સંગ્રહ હેતુનો ઉપયોગ કરો.એકત્રિત કરેલ પ્રકાશ લેઇકા DFC7000 CCD કેમેરા (Leica Microsystems, Germany) પર રેકોર્ડ કરવામાં આવ્યો હતો.BF અને DIC માઇક્રોસ્કોપી ઇમેજિંગ માટે એક્સપોઝરનો સમય 50 ms અને WF માઇક્રોસ્કોપી ઇમેજિંગ માટે 20-100 ms હતો.સરખામણી માટે, ThT સાથેના તમામ પ્રયોગો માટે એક્સપોઝર સમય 100 ms હતો.ડ્રોપલેટ કોલેસેન્સની કલ્પના કરવા માટે સમય-વિરામ પ્રયોગો કરવામાં આવ્યા હતા, જેમાં કેટલીક મિનિટો માટે દર 100 msએ છબીઓ એકત્રિત કરવામાં આવી હતી.ઈમેજજે (એનઆઈએચ, યુએસએ) નો ઉપયોગ ઈમેજ વિશ્લેષણ માટે કરવામાં આવ્યો હતો.સમાન પરિણામો સાથે પ્રયોગો ત્રિપુટીમાં હાથ ધરવામાં આવ્યા હતા.
સ્થાનિકીકરણ પ્રયોગો, FRAP અને 3D પુનઃનિર્માણ માટે, ZEN 2 બ્લુ એડિશન (કાર્લ ઝેઇસ એજી, ઓબરકોચેન, જર્મની) નો ઉપયોગ કરીને Zeiss LSM 880 ઇન્વર્ટેડ કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપ પર છબીઓ હસ્તગત કરવામાં આવી હતી.µ-સ્લાઇડ એન્જીયોજેનેસિસ પેટ્રી ડીશ (Ibidi GmbH, Gröfelfing, જર્મની) પર 50 μl ના નમૂનાઓ લાગુ કરવામાં આવ્યા હતા, જેને હાઇડ્રોફિલિક પોલિમર (ibiTreat) વડે સારવાર આપવામાં આવી હતી અને 63× તેલ નિમજ્જન ઉદ્દેશ્ય (પ્લાન-એપોક્રોમેટ 63.14/એનએ) માં માઉન્ટ કરવામાં આવી હતી. DIC પર).0.26 µm/પિક્સેલના રિઝોલ્યુશન સાથે 458 nm, 488 nm અને 633 nm આર્ગોન લેસર લાઈનોનો ઉપયોગ કરીને ઈમેજો હસ્તગત કરવામાં આવી હતી અને 470–600 nm, 628nm, 628nm ની ઉત્તેજના અને ઉત્સર્જન શોધ વિન્ડો માટે 8 µs/પિક્સેલનો એક્સપોઝર સમય હતો. અને 638–755 nm નો ઉપયોગ અનુક્રમે ThT, AF488 અને Atto647N ની કલ્પના કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.FRAP પ્રયોગો માટે, દરેક નમૂનાની ટાઈમ-લેપ્સ ફોટોગ્રાફી 1 ફ્રેમ પ્રતિ સેકન્ડના દરે રેકોર્ડ કરવામાં આવી હતી.પ્રયોગો સમાન પરિણામો સાથે ઓરડાના તાપમાને ત્રિપુટીમાં હાથ ધરવામાં આવ્યા હતા.ઝેન 2 બ્લુ એડિશન સોફ્ટવેર (કાર્લ ઝેઇસ એજી, ઓબરકોચેન, જર્મની) નો ઉપયોગ કરીને બધી છબીઓનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.ઓરિજિનપ્રો 9.1 નો ઉપયોગ કરીને ઝેન 2 નો ઉપયોગ કરીને ઇમેજમાંથી કાઢવામાં આવેલા તીવ્રતા/સમય ડેટા માટે FRAP વળાંકોને સામાન્ય, પ્લોટ અને ફીટ કરવામાં આવ્યા હતા.પુનઃપ્રાપ્તિ વણાંકો એક્વિઝિશન બ્લીચિંગ અસરને ધ્યાનમાં લેવા માટે વધારાના ઘાતાંકીય શબ્દ સાથે પરમાણુ પ્રસારને ધ્યાનમાં લેવા માટે મોનો-ઘાતાંકીય મોડેલમાં ફીટ કરવામાં આવ્યા હતા.અમે પછી નજીવી બ્લીચિંગ ત્રિજ્યાનો ઉપયોગ કરીને D ની ગણતરી કરી અને અગાઉ નિર્ધારિત પુનઃપ્રાપ્તિ હાફ-લાઇફ કાંગ એટ અલના સમીકરણમાં છે.5 35 બતાવ્યા.
αS ના સિંગલ સિસ્ટીન વેરિઅન્ટ્સ 24 (TEMPOL-24-αS) અને 122 (TEMPOL-122-αS) પર 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) સાથે સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યા હતા. અનુક્રમેસ્પિન લેબલીંગ EPR પ્રયોગો માટે, αS સાંદ્રતા 100 μM પર સેટ કરવામાં આવી હતી અને PEG સાંદ્રતા 15% (w/v) હતી.વિવિધ એકત્રીકરણ પરિસ્થિતિઓ માટે, αS:pLK ગુણોત્તર 1:10 હતો, જ્યારે αS:ΔNt-Tau અને αS:Tau441 ગુણોત્તર 1:1 પર જાળવવામાં આવ્યો હતો.ભીડની ગેરહાજરીમાં બંધનકર્તા ટાઇટ્રેશન પ્રયોગો માટે, TEMPOL-122-αS 50 μM પર જાળવવામાં આવ્યું હતું અને દરેક સ્થિતિને અલગથી તૈયાર કરીને, વધતી સાંદ્રતા પર પોલીકેશન્સ ટાઇટ્રેટ કરવામાં આવ્યા હતા.CW-EPR માપન ~9.7 GHz ની માઇક્રોવેવ (SHF) આવર્તન પર કાર્યરત Bruker ER4118 SPT-N1 રેઝોનેટરથી સજ્જ Bruker ELEXSYS E580 X-બેન્ડ સ્પેક્ટ્રોમીટરનો ઉપયોગ કરીને હાથ ધરવામાં આવ્યું હતું.તાપમાન 25 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર સેટ કરવામાં આવ્યું હતું અને પ્રવાહી નાઇટ્રોજન ક્રાયોસ્ટેટ દ્વારા નિયંત્રિત હતું.સ્પેક્ટ્રા 4 mW ની MW પાવર, 0.1 mT ના મોડ્યુલેશન કંપનવિસ્તાર અને 100 kHz ની મોડ્યુલેશન આવર્તન પર અસંતૃપ્ત પરિસ્થિતિઓમાં મેળવવામાં આવ્યા હતા.Tau441 અથવા ΔNt-Tau (મૂળ પ્રોટીન સોલ્યુશન્સમાં હાજર) ધરાવતા નમૂનાઓમાં ઘટાડાના એજન્ટોના અવશેષ સાંદ્રતાને કારણે નમૂનાઓ અને સંભવિત સ્પિન ઘટાડા વચ્ચેના સ્પિન સાંદ્રતામાં તફાવતને ટાળવા માટે સ્પેક્ટ્રલ તીવ્રતાને સામાન્ય બનાવવામાં આવી હતી.Matlab®67 માં અમલમાં મુકવામાં આવેલ Easyspin સોફ્ટવેર (v. 6.0.0-dev.34) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવેલ EPR સ્પેક્ટ્રલ મોડેલિંગના પરિણામે g ના આપેલ મૂલ્યો મેળવવામાં આવ્યા હતા.ડેટાનું મોડેલ બનાવવા માટે એક/બે ઘટક આઇસોટ્રોપિક મોડલ્સનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.બધા સંકેતોને સામાન્ય કર્યા પછી, અનુરૂપ પ્રાયોગિક સ્પેક્ટ્રમમાંથી દરેક સિમ્યુલેશનને બાદ કરીને અવશેષોની ગણતરી કરવામાં આવી હતી.બંધનકર્તા ટાઇટ્રેશન વિશ્લેષણ માટે, સામાન્યકૃત EPR સ્પેક્ટ્રમ (IIII/III) ના બીજા બેન્ડના ત્રીજા બેન્ડની સંબંધિત તીવ્રતાનો ઉપયોગ αS સાથે પોલિકેશનના બંધનનું નિરીક્ષણ કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.ડિસોસિએશન કોન્સ્ટન્ટ (Kd) નો અંદાજ કાઢવા માટે, પરિણામી વળાંક n સમાન અને સ્વતંત્ર બંધનકર્તા સાઇટ્સ ધારીને અંદાજિત મોડેલમાં ફીટ કરવામાં આવ્યો હતો.
NMR સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી પ્રયોગો Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR સ્પેક્ટ્રોમીટરનો ઉપયોગ કરીને હાથ ધરવામાં આવ્યા હતા જે ક્રાયોપ્રોબ અને Z-ગ્રેડિયન્ટથી સજ્જ હતા.બધા પ્રયોગો 130–207 µM αS અને અનુરૂપ αS/ΔNt-Tau અને pLK સમકક્ષનો ઉપયોગ કરીને 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 માં કરવામાં આવ્યા હતા અને 15°C પર કરવામાં આવ્યા હતા.NMR દ્વારા LPS પર દેખરેખ રાખવા માટે, પૂર્વ-મિશ્રિત નમૂનાઓમાં 10% PEG ઉમેરવામાં આવ્યું હતું.રાસાયણિક શિફ્ટ પેર્ટર્બેશન પ્લોટ (ફિગ. 1b) સરેરાશ 1H અને 15N રાસાયણિક શિફ્ટ દર્શાવે છે.αS 2D1H-15N HSQC સ્પેક્ટ્રાને અગાઉના અસાઇનમેન્ટ (BMRB એન્ટ્રી #25227)ના આધારે સોંપવામાં આવ્યા હતા અને HNCA, HNCO અને CBCAcoNH ના 3D સ્પેક્ટ્રાના રેકોર્ડિંગ અને વિશ્લેષણ દ્વારા પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી.13Cα અને 13Cβ રાસાયણિક પાળીની ગણતરી ΔNt-Tau અથવા pLK ની હાજરીમાં શુદ્ધ રેન્ડમ કોઇલ કન્ફોર્મેશન 68 (પૂરક આકૃતિ 5c) માં αS રાસાયણિક શિફ્ટ્સની તુલનામાં ગૌણ માળખાના વલણોમાં સંભવિત ફેરફારોને માપવા માટે કરવામાં આવી હતી.R1ρ દરો 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 અને 800 ms ના વિલંબ સાથે hsqctretf3gpsi પ્રયોગો (બ્રુકર લાઇબ્રેરીમાંથી મેળવેલ) રેકોર્ડ કરીને માપવામાં આવ્યા હતા, અને ઘાતાંકીય કાર્યોને વિલંબની ટોચ પર વિલંબિતતામાં ગોઠવવામાં આવ્યા હતા. R1ρ અને તેની પ્રાયોગિક અનિશ્ચિતતા નક્કી કરવાનો સમય.
સમય-સહસંબંધિત સિંગલ ફોટોન કાઉન્ટિંગ (TCSPC) ઉપકરણ સાથે વ્યાપારી સમય-ઉકેલિત MT200 ફ્લોરોસેન્સ કોન્ફોકલ માઈક્રોસ્કોપ (PicoQuant, બર્લિન, જર્મની) પર બે રંગીન સમય-ઉકેલિત ફ્લોરોસેન્સ માઇક્રોસ્કોપી પ્રયોગો કરવામાં આવ્યા હતા.લેસર ડાયોડ હેડનો ઉપયોગ પલ્સ્ડ ઈન્ટરલીવ્ડ એક્સિટેશન (PIE) માટે થાય છે, બીમ સિંગલ મોડ વેવગાઈડમાંથી પસાર થાય છે અને તેને 481 nm અને 637 nm લેસર લાઈનો માટે 10 થી 100 nW ની લેસર પાવર સાથે ટ્યુન કરવામાં આવે છે જે ડિક્રોઈક મિરર પછી માપવામાં આવે છે.આ ફોટોન એલિયાસિંગ, ફોટોબ્લીચિંગ અને સંતૃપ્તિની અસરોને ટાળીને, શ્રેષ્ઠ ફોટોન ગણતરી દરની ખાતરી કરે છે.μ-સ્લાઇડ એન્જીયોજેનેસિસ કવરસ્લિપ્સ અથવા પ્લેટ્સ (Ibidi GmbH, Gräfelfing, જર્મની) એક સુધારાત્મક કોલર (ઓલિમ્પસ લાઇફ સાયન્સ, વોલ્થમ, યુએસએ) સાથે સુપર એપોક્રોમેટ 60x NA 1.2 લેન્સ પર સીધા જ નિમજ્જન પાણીમાં મૂકવામાં આવી હતી.એક 488/640 nm ડાયક્રોઇક મિરર (સેમરોક, લેક ફોરેસ્ટ, IL, USA) મુખ્ય બીમ સ્પ્લિટર તરીકે ઉપયોગમાં લેવાય છે.અનફોકસ્ડ રેડિયેશનને 50 માઇક્રોનના વ્યાસવાળા છિદ્ર દ્વારા અવરોધિત કરવામાં આવે છે, પછી કેન્દ્રિત રેડિયેશનને 50/50 બીમ સ્પ્લિટર દ્વારા 2 શોધ પાથમાં વિભાજિત કરવામાં આવે છે.બેન્ડપાસ ઉત્સર્જન ફિલ્ટર્સ (સેમરોક, લેક ફોરેસ્ટ, IL, USA) 520/35 લીલા રંગ માટે (AF488) અને 690/70 લાલ રંગ માટે (Atto647N) ડિટેક્ટરની સામે ઉપયોગમાં લેવાયા હતા.સિંગલ-ફોટન હિમપ્રપાત ડાયોડ્સ (SPAD) (માઈક્રો ફોટોન ઉપકરણો, બોલઝાનો, ઇટાલી) નો ઉપયોગ ડિટેક્ટર તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો.વ્યાપારી રીતે ઉપલબ્ધ SymphoTime64 સોફ્ટવેર (PicoQuant GmbH, બર્લિન, જર્મની) નો ઉપયોગ કરીને ડેટા સંગ્રહ અને વિશ્લેષણ બંને કરવામાં આવ્યા હતા.
એલએલપીએસ નમૂનાઓના પચાસ માઇક્રોલિટર μ-સ્લાઇડ એન્જીયોજેનેસિસ કુવાઓ (આઇબીડી જીએમબીએચ, ગ્રેફેલ્ફિંગ, જર્મની) પર લાગુ કરવામાં આવ્યા હતા.પરિણામી છબીઓ સસ્પેન્ડેડ ટીપું માટે શ્રેષ્ઠ ઉદ્દેશ્ય કાર્યકારી અંતર માટે કૂવાના તળિયે 20 µm ઉપર અને ઓછામાં ઓછા 0.25 µm/પિક્સેલના અક્ષીય રિઝોલ્યુશન સાથે અને 400 µs/પિક્સેલના વિલંબ સમય સાથે રાફ્ટ્સ અને બિંદુઓ માટે ~1 µm પર કેન્દ્રિત છે.દરેક ચેનલ માટે સરેરાશ પૃષ્ઠભૂમિ સિગ્નલ તીવ્રતા (PBG, સરેરાશ + 2σ) ના આધારે તીવ્રતા થ્રેશોલ્ડ લાગુ કરીને ડેટા પસંદ કરો જેથી કરીને વિખરાયેલા તબક્કામાંથી કોઈપણ સંભવિત મૂળને ફિલ્ટર કરીને માત્ર પ્રવાહી પ્રોટીન ટીપાં, રાફ્ટ્સ અથવા ફોલ્લીઓ પસંદ કરવામાં આવે.દરેક ચેનલની દરેક પ્રજાતિ (τ) ના જીવનકાળનું પૃથ્થકરણ કરવા માટે (એએફ488 માટે લીલો, “g” અને લાલ, Atto647N માટે “r”), અમે ટીપું, રાફ્ટ્સ અથવા ફોલ્લીઓ ધરાવતા રસના પ્રદેશો (ROIs) પસંદ કર્યા છે (પૂરક આકૃતિ 1 ).8b) અને દરેક ચેનલમાં પૂંછડી-ફિટ વિશ્લેષણ અને બે ઘટક સડો મોડલનો ઉપયોગ કરીને તેમના જીવનકાળના સડો (ટીપ, રાફ્ટ્સ અથવા ફોલ્લીઓ માટે τD, τR અને τP અનુક્રમે, પૂરક ફિગ જુઓ. 8c જુઓ) ફીટ કરીને તેમને મેળવ્યા.સરેરાશ τ થી τ .ROI જે બહુ-ઘાતાંકીય ફિટ માટે બહુ ઓછા ફોટોન ઉત્પન્ન કરે છે તેને વિશ્લેષણમાંથી બાકાત રાખવામાં આવ્યા હતા.વપરાયેલ કટઓફ રાફ્ટ્સ અને ડોટ્સ માટે <104 ફોટોન અને ટીપાં માટે 103 હતા.ટીપું નીચું થ્રેશોલ્ડ ધરાવે છે કારણ કે ઉચ્ચ તીવ્રતાના મૂલ્યો સાથે સડો વળાંક મેળવવો મુશ્કેલ છે, કારણ કે ઇમેજ ફીલ્ડમાં ટીપું સામાન્ય રીતે નાના અને ઓછા અસંખ્ય હોય છે.ફોટોન સંચય મર્યાદા (>500 કાઉન્ટ્સ/પિક્સેલ પર સેટ) કરતાં વધુ ફોટોન ગણતરીઓ સાથેના ROI પણ વિશ્લેષણ માટે કાઢી નાખવામાં આવ્યા હતા.સેવા જીવનની શરૂઆતથી મહત્તમ 90% (સડોની મહત્તમ તીવ્રતા પછી સહેજ) ની તીવ્રતા સાથે રસના પ્રદેશમાંથી મેળવેલા તીવ્રતાના સડો વળાંકને મેળવો જેથી લઘુત્તમ IRF હસ્તક્ષેપ સુનિશ્ચિત થાય અને તમામ તીવ્રતાના ક્ષય માટે સમાન જાળવી શકાય. સેટિંગ્સ સાપેક્ષ સમય વિન્ડો રાફ્ટ્સ અને સ્પોટ્સ માટે 25 થી 50 ROI અને ટીપાં માટે 15-25 ROI નું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું, ઓછામાં ઓછા 3 સ્વતંત્ર પ્રયોગોમાંથી રેકોર્ડ કરાયેલ 4 થી વધુ પ્રતિકૃતિઓમાંથી પસંદ કરેલી છબીઓ.દ્વિ-પૂંછડીવાળા ટી-ટેસ્ટનો ઉપયોગ પ્રજાતિઓ વચ્ચે અથવા કોસર્વેટ સિસ્ટમ્સ વચ્ચેના આંકડાકીય તફાવતોનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે કરવામાં આવ્યો છે.જીવનકાળ (τ) ના પિક્સેલ-બાય-પિક્સેલ વિશ્લેષણ માટે, દરેક ચેનલ માટે ફીલ્ડ પરના જીવનકાળના કુલ એટેન્યુએશનની ગણતરી કરવામાં આવી હતી અને 2/3-ઘટક ઘાતાંકીય એટેન્યુએશન મોડલની અંદાજિત ગણતરી હાથ ધરવામાં આવી હતી.દરેક પિક્સેલ માટે લાઇફટાઇમ એટેન્યુએશન પછી અગાઉ ગણતરી કરેલ τ મૂલ્યોનો ઉપયોગ કરીને ફીટ કરવામાં આવ્યું હતું, પરિણામે સ્યુડોકલર FLIM ફિટ ઈમેજ.પૂંછડી-ફિટ જીવનકાળ શ્રેણી સમાન ચેનલની તમામ છબીઓમાં સમાન હતી, અને દરેક સડો વિશ્વસનીય ફિટ પ્રદાન કરવા માટે પૂરતા ફોટોન ઉત્પન્ન કરે છે.FRET વિશ્લેષણ માટે, 100 ફોટોનની નીચી તીવ્રતા થ્રેશોલ્ડ લાગુ કરીને પિક્સેલ પસંદ કરવામાં આવ્યા હતા, જે 11 ફોટોનનું બેકગ્રાઉન્ડ સિગ્નલ (FBG) સરેરાશ ધરાવે છે.દરેક ચેનલની ફ્લોરોસેન્સ તીવ્રતા પ્રાયોગિક રીતે નિર્ધારિત કરેક્શન પરિબળો દ્વારા સુધારવામાં આવી હતી: 69 સ્પેક્ટ્રલ ક્રોસસ્ટૉક α 0.004 હતી, પ્રત્યક્ષ ઉત્તેજના β 0.0305 હતી, શોધ કાર્યક્ષમતા γ 0.517 હતી.પિક્સેલ સ્તર પર FRET કાર્યક્ષમતા પછી નીચેના સમીકરણનો ઉપયોગ કરીને ગણતરી કરવામાં આવે છે:
જ્યાં FDD એ દાતા (ગ્રીન) ચેનલમાં જોવા મળતી ફ્લોરોસેન્સ તીવ્રતા છે, FDA એ પરોક્ષ ઉત્તેજના હેઠળ સ્વીકારનાર (લાલ) ચેનલમાં અવલોકન કરાયેલ ફ્લોરોસેન્સ તીવ્રતા છે, અને FAA એ પ્રત્યક્ષ ઉત્તેજના હેઠળ સ્વીકારનાર (લાલ) ચેનલમાં અવલોકન કરાયેલ ફ્લોરોસેન્સ તીવ્રતા છે. PIE).ચેનલમાં ફ્લોરોસેન્સ તીવ્રતાના કઠોળ જોવા મળે છે).
એડહેસિવ ફોઇલ કોટિંગ સાથે બિન-બંધનકર્તા 96-વેલ માઇક્રોપ્લેટ્સ પર LLPS બફર (ઉપર મુજબ પૂરક) માં 25 µM અનલેબલ વગરના મોનોમેરિક Tau441 (25 µM αS સાથે અથવા વગર) ધરાવતા LLPS રિએક્શન સોલ્યુશન્સનો 100 µl મૂકો અને ડબલ્યુએફ ફોર્મેટ પછી માઇક્રોપ્લેટની ચકાસણી કરવામાં આવી હતી. સંતુલન10 મિનિટની અંદર.ઓરડાના તાપમાને ઇન્ક્યુબેશનના 48 કલાક પછી, પ્રોટીન રાફ્ટ્સ અને ફોલ્લીઓની હાજરીની પુષ્ટિ થઈ.પછી કુવાઓમાંથી રાફ્ટ્સ પરના પ્રવાહીને કાળજીપૂર્વક દૂર કરો, પછી 50 L ડિસોસિએશન બફર (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) ઉમેરો અને 10 મિનિટ માટે સેવન કરો.ઉચ્ચ મીઠાની સાંદ્રતા એ સુનિશ્ચિત કરે છે કે શેષ પીઈજીને કારણે એલએલપીએસ પુનરાવર્તિત થશે નહીં, અને માત્ર ઈલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ દ્વારા રચાયેલી સંભવિત પ્રોટીન એસેમ્બલીઓને ડિસએસેમ્બલ કરવામાં આવશે.પછી કૂવાના તળિયાને માઇક્રોપીપેટ ટીપ વડે કાળજીપૂર્વક સ્ક્રેપ કરવામાં આવ્યું હતું અને પરિણામી દ્રાવણને ખાલી અવલોકન કૂવામાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવ્યું હતું.1 કલાક માટે 50 μM ThT સાથે નમૂનાઓના સેવન પછી, ડબલ્યુએફ માઇક્રોસ્કોપી દ્વારા અલગ સ્થળોની હાજરી તપાસવામાં આવી હતી.પીબીએસમાં pH 7.4 સાથે 70-µM αS સોલ્યુશનના 300 µl, 37 °C પર સોડિયમ એઝાઈડ 0.01% અને ઓર્બિટલ શેકર પર 200 rpm 7 દિવસ માટે ઉકાળીને સોનિકેટેડ αS ફાઈબ્રિલ્સ તૈયાર કરો.પછી સોલ્યુશનને 30 મિનિટ માટે 9600×g પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું, પેલેટને PBS pH 7.4 માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યું હતું અને સોનિકેટેડ (1 મિનિટ, 50% ચક્ર, વાઇબ્રા-સેલ VC130 સોનિકેટરમાં 80% કંપનવિસ્તાર, Sonics, Newton, USA) સેમ્પલ નાના ફાઈબ્રિલ્સના પ્રમાણમાં સમાન કદના વિતરણ સાથે.
PIE મોડનો ઉપયોગ કરીને FLIM-FRET માઈક્રોસ્કોપી પ્રયોગો માટે ઉપયોગમાં લેવાતા સમાન MT200 સમય-નિરાકરણવાળા ફ્લોરોસન્ટ કોન્ફોકલ માઈક્રોસ્કોપ (પીકો-ક્વોન્ટ, બર્લિન, જર્મની) પર FCS/FCCS વિશ્લેષણ અને દ્વિ-રંગી સંયોગ શોધ (TCCD) કરવામાં આવ્યા હતા.આ પ્રયોગો માટે લેસર પાવર 6.0 µW (481 nm) અને 6.2 µW (637 nm) માં ઉમેરવામાં આવ્યો હતો.આ લેસર શક્તિઓનું સંયોજન શ્રેષ્ઠ ગણતરી દર હાંસલ કરતી વખતે અને ફોટોબ્લીચિંગ અને સંતૃપ્તિને ટાળતી વખતે ઉપયોગમાં લેવાતા ફ્લોરોફોર્સની જોડી માટે સમાન તેજ પેદા કરવા માટે પસંદ કરવામાં આવ્યું હતું.વ્યાપારી રીતે ઉપલબ્ધ SymphoTime64 સંસ્કરણ 2.3 સોફ્ટવેર (PicoQuant, બર્લિન, જર્મની) નો ઉપયોગ કરીને ડેટા સંગ્રહ અને વિશ્લેષણ બંને કરવામાં આવ્યા હતા.
એલએલપીએસનો ઉપયોગ કરીને મેળવેલ આઇસોલેટેડ αS/Tau એગ્રીગેટ્સના નમૂનાઓ યોગ્ય મોનોમોલેક્યુલર સાંદ્રતામાં આઇસોલેશન બફરમાં ભળી જાય છે (સામાન્ય રીતે 1:500 મંદન, કારણ કે જ્યારે કોસર્વેટ નમૂનાઓથી અલગ કરવામાં આવે ત્યારે એગ્રીગેટ્સ પહેલેથી જ ઓછી સાંદ્રતામાં હોય છે).નમૂનાઓ 1 mg/mL ની સાંદ્રતા પર BSA સોલ્યુશન સાથે પ્રીકોટેડ કવરસ્લિપ્સ (કોર્નિંગ, યુએસએ) પર સીધા જ લાગુ કરવામાં આવ્યા હતા.
લીલી અને લાલ ચેનલોમાં PIE-smFRET પૃથ્થકરણ માટે, મોનોમેરિક ઘટનાઓને કારણે ઓછી તીવ્રતાના સિગ્નલોને ફિલ્ટર કરવા માટે 25 ફોટોનનો નીચો તીવ્રતાનો થ્રેશોલ્ડ લાગુ કરવામાં આવ્યો હતો (નોંધ કરો કે મોનોમર્સ આઇસોલેટેડ એગ્રીગેટ્સની સરખામણીમાં એકંદર સેમ્પલ કરતાં વધુ છે).આ થ્રેશોલ્ડની ગણતરી શુદ્ધ મોનોમર નમૂનાઓના પૃથ્થકરણમાંથી મેળવવામાં આવેલી મોનોમેરિક αS ની સરેરાશ તીવ્રતાના પાંચ ગણી તરીકે કરવામાં આવી હતી જેથી વિશ્લેષણ માટે વિશિષ્ટ રીતે એકંદર પસંદ કરવામાં આવે.PIE ડ્રાઇવ સર્કિટ, TSCPC ડેટા એક્વિઝિશન સાથે, આજીવન વેઇટિંગ ફિલ્ટરની એપ્લિકેશનને સક્ષમ કરી છે જે પૃષ્ઠભૂમિ અને સ્પેક્ટ્રલ ક્રોસસ્ટૉકને દૂર કરવામાં મદદ કરે છે.ઉપરોક્ત થ્રેશોલ્ડનો ઉપયોગ કરીને પસંદ કરેલ જ્વાળાની તીવ્રતા બફર-માત્ર નમૂનાઓની તીવ્રતા/બિન વિરુદ્ધ ઘટનાના હિસ્ટોગ્રામ્સમાંથી નિર્ધારિત સરેરાશ પૃષ્ઠભૂમિ સિગ્નલનો ઉપયોગ કરીને સુધારવામાં આવી હતી.મોટા એકંદર સાથે સંકળાયેલા વિસ્ફોટો સામાન્ય રીતે ટાઈમ ટ્રેસ (1 ms પર સેટ) માં સળંગ અનેક ડબ્બા ધરાવે છે.આ કિસ્સાઓમાં, મહત્તમ શક્તિનો ડબ્બો પસંદ કરવામાં આવ્યો હતો.FRET અને stoichiometric વિશ્લેષણ માટે, સૈદ્ધાંતિક રીતે નિર્ધારિત ગામા પરિબળ γ (0.517) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.ઉપયોગમાં લેવાતી ઉત્તેજના લેસર પાવર પર સ્પેક્ટ્રલ ક્રોસસ્ટૉક અને પ્રત્યક્ષ ઉત્તેજના યોગદાન નગણ્ય છે (પ્રયોગાત્મક રીતે નિર્ધારિત).વિસ્ફોટમાં FRET ની કાર્યક્ષમતા અને stoichiometry નીચે પ્રમાણે ગણવામાં આવે છે.