304 સ્ટેનલેસ સ્ટીલ કોઇલ ટ્યુબિંગ રાસાયણિક ઘટક ,SPACA6 એક્ટોડોમેનનું માળખું ગેમેટ ફ્યુઝન સાથે સંકળાયેલ પ્રોટીનનું સંરક્ષિત સુપરફેમિલી ધરાવે છે.

Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર.તમે મર્યાદિત CSS સપોર્ટ સાથે બ્રાઉઝર સંસ્કરણનો ઉપયોગ કરી રહ્યાં છો.શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે અપડેટ કરેલ બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરો (અથવા Internet Explorer માં સુસંગતતા મોડને અક્ષમ કરો).વધુમાં, ચાલુ સમર્થનની ખાતરી કરવા માટે, અમે શૈલીઓ અને JavaScript વિના સાઇટ બતાવીએ છીએ.
સ્લાઇડર્સ સ્લાઇડ દીઠ ત્રણ લેખો દર્શાવે છે.સ્લાઇડ્સમાંથી આગળ વધવા માટે પાછળના અને આગળના બટનોનો ઉપયોગ કરો અથવા દરેક સ્લાઇડમાંથી આગળ વધવા માટે અંતે સ્લાઇડ કંટ્રોલર બટનોનો ઉપયોગ કરો.

SPACA6 એ શુક્રાણુ-વ્યક્ત સપાટી પ્રોટીન છે જે સસ્તન પ્રાણીઓના જાતીય પ્રજનન દરમિયાન ગેમેટ ફ્યુઝન માટે મહત્વપૂર્ણ છે.આ મૂળભૂત ભૂમિકા હોવા છતાં, SPACA6 નું વિશિષ્ટ કાર્ય ખરાબ રીતે સમજી શકાયું નથી.અમે 2.2 Å ના રિઝોલ્યુશન પર SPACA6 ના એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર ડોમેનનું સ્ફટિક માળખું સ્પષ્ટ કરીએ છીએ, જેમાં ચાર-સ્ટ્રેન્ડેડ બંડલ અને Ig-જેવા β-સેન્ડવિચ અર્ધ-લવચીક લિંકર્સ દ્વારા જોડાયેલા બે-ડોમેન પ્રોટીનને છતી કરે છે.આ માળખું IZUMO1 જેવું લાગે છે, જે અન્ય ગેમેટ ફ્યુઝન-સંબંધિત પ્રોટીન છે, જે SPACA6 અને IZUMO1 ને ગર્ભાધાન-સંબંધિત પ્રોટીનની સુપરફેમિલીના સ્થાપક સભ્યો બનાવે છે જેને અહીં IST સુપરફેમિલી તરીકે ઓળખવામાં આવે છે.IST સુપરફેમિલીને તેના ટ્વિસ્ટેડ ચાર-હેલિક્સ બંડલ અને ડાયસલ્ફાઇડ-લિંક્ડ CXXC મોટિફ્સની જોડી દ્વારા માળખાકીય રીતે વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવે છે.માનવ પ્રોટીઓમની રચના-આધારિત આલ્ફાફોલ્ડ શોધે આ સુપરફેમિલીના વધારાના પ્રોટીન સભ્યોની ઓળખ કરી;નોંધપાત્ર રીતે, આમાંના ઘણા પ્રોટીન ગેમેટ ફ્યુઝનમાં સામેલ છે.SPACA6 માળખું અને IST ના અન્ય સભ્યો સાથેનો તેનો સંબંધ સુપરફેમિલી સસ્તન પ્રાણી ગેમેટ ફ્યુઝનના અમારા જ્ઞાનમાં ખૂટતી કડી પ્રદાન કરે છે.
દરેક માનવ જીવનની શરૂઆત બે અલગ-અલગ હેપ્લોઇડ ગેમેટ્સથી થાય છે: પિતાના શુક્રાણુ અને માતાનું ઇંડા.આ શુક્રાણુ એક તીવ્ર પસંદગી પ્રક્રિયાનો વિજેતા છે જે દરમિયાન લાખો શુક્રાણુ કોષો સ્ત્રીના જનન માર્ગમાંથી પસાર થાય છે, વિવિધ અવરોધોને પાર કરે છે અને કેપેસીટેશનમાંથી પસાર થાય છે, જે તેમની ગતિશીલતા અને સપાટીના ઘટકો 2,3,4ની પ્રક્રિયાને વધારે છે.જો શુક્રાણુ અને oocyte એકબીજાને શોધી કાઢે તો પણ, પ્રક્રિયા હજી પૂરી થઈ નથી.oocyte ક્યુમ્યુલસ કોશિકાઓના સ્તર અને ગ્લાયકોપ્રોટીન અવરોધથી ઘેરાયેલું છે જેને ઝોના પેલ્યુસિડા કહેવાય છે, જેમાંથી શુક્રાણુએ oocyte માં પ્રવેશવા માટે પસાર થવું જોઈએ.સ્પર્મેટોઝોઆ આ અંતિમ અવરોધોને દૂર કરવા માટે સપાટીના સંલગ્ન અણુઓ અને પટલ-સંબંધિત અને સ્ત્રાવિત ઉત્સેચકોના સંયોજનનો ઉપયોગ કરે છે.આ પરમાણુઓ અને ઉત્સેચકો મુખ્યત્વે આંતરિક પટલ અને એક્રોસોમલ મેટ્રિક્સમાં સંગ્રહિત થાય છે અને જ્યારે એક્રોસોમલ પ્રતિક્રિયા6 દરમિયાન શુક્રાણુના બાહ્ય પટલને લીસ કરવામાં આવે છે ત્યારે તે શોધી કાઢવામાં આવે છે.આ સઘન પ્રવાસનું અંતિમ પગલું એ શુક્રાણુ-ઇંડાનું સંમિશ્રણ ઘટના છે, જેમાં બે કોષો તેમના પટલને ફ્યુઝ કરીને એક જ ડિપ્લોઇડ સજીવ બને છે7.માનવ પ્રજનનમાં આ પ્રક્રિયા ગ્રાઉન્ડબ્રેકિંગ હોવા છતાં, જરૂરી પરમાણુ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ નબળી રીતે સમજી શકાય છે.
ગેમેટ્સના ગર્ભાધાન ઉપરાંત, બે લિપિડ બાયલેયર્સના મિશ્રણની રસાયણશાસ્ત્રનો વ્યાપકપણે અભ્યાસ કરવામાં આવ્યો છે.સામાન્ય રીતે, મેમ્બ્રેન ફ્યુઝન એ એક ઊર્જાસભર પ્રતિકૂળ પ્રક્રિયા છે જેને માળખાકીય રચનામાં ફેરફાર કરવા માટે પ્રોટીન ઉત્પ્રેરકની જરૂર પડે છે જે બે પટલને એકબીજાની નજીક લાવે છે, તેમની સાતત્યતા તોડે છે અને ફ્યુઝન 8,9નું કારણ બને છે.આ પ્રોટીન ઉત્પ્રેરકને ફ્યુસોજેન્સ તરીકે ઓળખવામાં આવે છે અને અસંખ્ય ફ્યુઝન સિસ્ટમ્સમાં જોવા મળે છે.તેઓ યજમાન કોષોમાં વાયરલ પ્રવેશ માટે જરૂરી છે (દા.ત., HIV-1 માં gp160, કોરોનાવાયરસમાં સ્પાઇક, ઈન્ફલ્યુએન્ઝા વાયરસમાં હેમાગ્લુટીનિન) 10,11,12 પ્લેસેન્ટલ (સિન્સીટીન) 13,14,15 અને નીચલા યુકેરીયોટ્સમાં ગેમેટ-ફોર્મિંગ ફ્યુઝન ( છોડ, પ્રોટીસ્ટ અને આર્થ્રોપોડ્સમાં HAP2/GCS1) 16,17,18,19.માનવ ગેમેટ્સ માટેના ફ્યુસોજેન્સ હજુ સુધી શોધવામાં આવ્યા નથી, જોકે ઘણા પ્રોટીન ગેમેટ જોડાણ અને ફ્યુઝન માટે મહત્વપૂર્ણ હોવાનું દર્શાવવામાં આવ્યું છે.oocyte-expressed CD9, માઉસ અને માનવ ગેમેટ્સના ફ્યુઝન માટે જરૂરી ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન પ્રોટીન, 21,22,23 શોધાયેલું પ્રથમ હતું.તેમ છતાં તેનું ચોક્કસ કાર્ય અસ્પષ્ટ રહે છે, સંલગ્નતામાં ભૂમિકા, ઇંડા માઇક્રોવિલી પર સંલગ્નતા ફોસીનું માળખું અને/અથવા oocyte સપાટી પ્રોટીનનું સાચું સ્થાનિકીકરણ 24,25,26 સંભવિત લાગે છે.ગેમેટ ફ્યુઝન માટે નિર્ણાયક એવા બે સૌથી લાક્ષણિક પ્રોટીન છે શુક્રાણુ પ્રોટીન IZUMO127 અને oocyte પ્રોટીન JUNO28, અને તેમના પરસ્પર જોડાણ એ ફ્યુઝન પહેલા ગેમેટની ઓળખ અને સંલગ્નતામાં એક મહત્વપૂર્ણ પગલું છે.નર ઇઝુમો1 નોકઆઉટ ઉંદર અને માદા જુનો નોકઆઉટ ઉંદર સંપૂર્ણપણે જંતુરહિત છે, આ મોડેલોમાં શુક્રાણુ પેરીવિટેલલાઇન જગ્યામાં પ્રવેશ કરે છે પરંતુ ગેમેટ્સ ફ્યુઝ થતા નથી.એ જ રીતે, માનવમાં વિટ્રો ગર્ભાધાન પ્રયોગોમાં જ્યારે ગેમેટ્સને એન્ટિ-IZUMO1 અથવા JUNO27,29 એન્ટિબોડીઝ સાથે સારવાર આપવામાં આવી ત્યારે સંગમમાં ઘટાડો થયો હતો.
તાજેતરમાં, IZUMO1 અને JUNO20,30,31,32,33,34,35 જેવા જ વીર્ય-વ્યક્ત પ્રોટીનનું નવું શોધાયેલ જૂથ શોધાયું છે.મોટા પાયે મ્યુરિન મ્યુટાજેનેસિસ અભ્યાસમાં વીર્ય એક્રોસોમલ મેમ્બ્રેન-સંબંધિત પ્રોટીન 6 (SPACA6) ને ગર્ભાધાન માટે આવશ્યક તરીકે ઓળખવામાં આવ્યું છે.Spaca6 જનીનમાં ટ્રાન્સજીન દાખલ કરવાથી બિન-ફ્યુઝીબલ શુક્રાણુઓ ઉત્પન્ન થાય છે, જો કે આ શુક્રાણુઓ પેરીવિટેલીન સ્પેસમાં ઘૂસણખોરી કરે છે 36.ઉંદરમાં અનુગામી નોકઆઉટ અભ્યાસોએ પુષ્ટિ કરી કે ગેમેટ ફ્યુઝન 30,32 માટે Spaca6 જરૂરી છે.SPACA6 લગભગ માત્ર વૃષણમાં જ વ્યક્ત થાય છે અને તે IZUMO1 ની જેમ જ સ્થાનિકીકરણ પેટર્ન ધરાવે છે, એટલે કે એક્રોસોમલ પ્રતિક્રિયા પહેલા શુક્રાણુઓની અંદરની અંદર, અને પછી એક્રોસોમલ પ્રતિક્રિયા 30,32 પછી વિષુવવૃત્તીય પ્રદેશમાં સ્થળાંતર કરે છે.Spaca6 હોમોલોગ્સ વિવિધ સસ્તન પ્રાણીઓ અને અન્ય યુકેરીયોટ્સ 30 માં અસ્તિત્વ ધરાવે છે અને માનવ ગેમેટ ફ્યુઝન માટે તેનું મહત્વ SPACA6 30 ના પ્રતિકાર દ્વારા વિટ્રોમાં માનવ ગર્ભાધાનના અવરોધ દ્વારા દર્શાવવામાં આવ્યું છે.IZUMO1 અને JUNO થી વિપરીત, SPACA6 ની રચના, ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ અને કાર્યની વિગતો અસ્પષ્ટ રહે છે.
માનવ શુક્રાણુ અને ઇંડાના સંમિશ્રણ હેઠળની મૂળભૂત પ્રક્રિયાને વધુ સારી રીતે સમજવા માટે, જે અમને કુટુંબ નિયોજન અને પ્રજનનક્ષમતા સારવારમાં ભવિષ્યના વિકાસની જાણ કરવામાં સક્ષમ બનાવશે, અમે SPACA6 માળખાકીય અને બાયોકેમિકલ અભ્યાસ હાથ ધર્યા.SPACA6 ના એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર ડોમેનનું સ્ફટિક માળખું ચાર-હેલિકલ બંડલ (4HB) અને અર્ધ-લવચીક પ્રદેશો દ્વારા જોડાયેલ ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન જેવું (Ig-જેવું) ડોમેન દર્શાવે છે.અગાઉના અભ્યાસોમાં અનુમાન મુજબ, 7,32,37 SPACA6 નું ડોમેન માળખું માનવ IZUMO1 જેવું જ છે, અને બે પ્રોટીન એક અસામાન્ય હેતુ ધરાવે છે: ત્રિકોણાકાર હેલિકલ સપાટી સાથે 4HB અને ડાયસલ્ફાઇડ-લિંક્ડ CXXC મોટિફ્સની જોડી.અમે દરખાસ્ત કરીએ છીએ કે IZUMO1 અને SPACA6 હવે ગેમેટ ફ્યુઝન સાથે સંકળાયેલ પ્રોટીનની વિશાળ, માળખાકીય રીતે સંબંધિત સુપરફેમિલીને વ્યાખ્યાયિત કરે છે.સુપરફેમિલી માટે અનન્ય સુવિધાઓનો ઉપયોગ કરીને, અમે આલ્ફાફોલ્ડ સ્ટ્રક્ચરલ હ્યુમન પ્રોટીઓમ માટે સંપૂર્ણ શોધ હાથ ધરી છે, જેમાં ગેમેટ ફ્યુઝન અને/અથવા ગર્ભાધાન સાથે સંકળાયેલા કેટલાક સભ્યો સહિત આ સુપરફેમિલીના વધારાના સભ્યોની ઓળખ કરવામાં આવી છે.હવે એવું લાગે છે કે ગેમેટ ફ્યુઝન સાથે સંકળાયેલ પ્રોટીનનો એક સામાન્ય માળખાકીય ગણો અને સુપરફેમિલી છે, અને આપણું માળખું માનવ ગેમેટ ફ્યુઝન મિકેનિઝમના આ મહત્વપૂર્ણ પાસાંનો પરમાણુ નકશો પૂરો પાડે છે.
SPACA6 એ એક N-લિંક્ડ ગ્લાયકેન અને છ પુટેટિવ ​​ડિસલ્ફાઇડ બોન્ડ્સ (ફિગર્સ S1a અને S2) સાથે સિંગલ-પાસ ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન પ્રોટીન છે.અમે ડ્રોસોફિલા S2 કોષોમાં માનવ SPACA6 (અવશેષો 27–246) નું એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર ડોમેન વ્યક્ત કર્યું અને નિકલ એફિનિટી, કેશન એક્સચેન્જ અને સાઇઝ એક્સક્લુઝન ક્રોમેટોગ્રાફી (ફિગ. S1b) નો ઉપયોગ કરીને પ્રોટીનને શુદ્ધ કર્યું.શુદ્ધ SPACA6 એક્ટોડોમેન ખૂબ જ સ્થિર અને સજાતીય છે.બહુકોણીય પ્રકાશ સ્કેટરિંગ (SEC-MALS) સાથે સંયુક્ત કદના બાકાત ક્રોમેટોગ્રાફીનો ઉપયોગ કરીને વિશ્લેષણમાં 26.2 ± 0.5 kDa (ફિગ. S1c) ના ગણતરી કરેલ મોલેક્યુલર વજન સાથે એક શિખર બહાર આવ્યું.આ SPACA6 મોનોમેરિક એક્ટોડોમેનના કદ સાથે સુસંગત છે, જે દર્શાવે છે કે શુદ્ધિકરણ દરમિયાન ઓલિગોમેરાઇઝેશન થયું નથી.વધુમાં, ગોળાકાર ડિક્રોઈઝમ (CD) સ્પેક્ટ્રોસ્કોપીએ 51.3 °C (ફિગ. S1d,e) ના ગલનબિંદુ સાથે મિશ્ર α/β માળખું જાહેર કર્યું.સીડી સ્પેક્ટ્રાના ડીકોનવોલ્યુશનથી 38.6% α-હેલિકલ અને 15.8% β-સ્ટ્રેન્ડેડ તત્વો (આકૃતિ S1d) પ્રગટ થયા.
SPACA6 એક્ટોડોમેનને રેન્ડમ મેટ્રિક્સ સીડીંગ 38 નો ઉપયોગ કરીને સ્ફટિકીકરણ કરવામાં આવ્યું હતું જેના પરિણામે 2.2 Å (કોષ્ટક 1 અને આકૃતિ S3) ના રિઝોલ્યુશન સાથે ડેટા સેટ થયો હતો.માળખાના નિર્ધારણ (કોષ્ટક 1 અને આકૃતિ S4) માટે ફ્રેગમેન્ટ-આધારિત પરમાણુ અવેજીકરણ અને બ્રોમાઇડ એક્સપોઝર સાથે SAD તબક્કાવાર ડેટાના સંયોજનનો ઉપયોગ કરીને, અંતિમ શુદ્ધ મોડલ 27-246 અવશેષો ધરાવે છે.જે સમયે માળખું નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું, ત્યાં કોઈ પ્રાયોગિક અથવા આલ્ફાફોલ્ડ સ્ટ્રક્ચર્સ ઉપલબ્ધ નહોતા.SPACA6 એક્ટોડોમેઇન 20 Å × 20 Å × 85 Å માપે છે, જેમાં સાત હેલિકો અને નવ β-સ્ટ્રેન્ડ્સનો સમાવેશ થાય છે, અને છ ડિસલ્ફાઇડ બોન્ડ્સ (ફિગ. 1a, b) દ્વારા સ્થિર થયેલો વિસ્તૃત તૃતીય ગણો ધરાવે છે.Asn243 બાજુની સાંકળના અંતે નબળી ઇલેક્ટ્રોન ઘનતા સૂચવે છે કે આ અવશેષ એન-લિંક્ડ ગ્લાયકોસિલેશન છે.બંધારણમાં બે ડોમેન્સનો સમાવેશ થાય છે: એક N-ટર્મિનલ ચાર-હેલિક્સ બંડલ (4HB) અને C-ટર્મિનલ Ig-જેવું ડોમેન જેમાં તેમની વચ્ચે મધ્યવર્તી હિન્જ ક્ષેત્ર છે (ફિગ. 1c).
SPACA6 ના એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર ડોમેનનું માળખું.SPACA6 ના એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર ડોમેનનો સ્ટ્રીપ ડાયાગ્રામ, N થી C-ટર્મિનસ સુધીની સાંકળનો રંગ ઘેરો વાદળીથી ઘેરો લાલ.ડાયસલ્ફાઇડ બોન્ડમાં સામેલ સિસ્ટીન કિરમજી રંગમાં પ્રકાશિત થાય છે.b SPACA6 ના એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર ડોમેનની ટોપોલોજી.આકૃતિ 1a માં સમાન રંગ યોજનાનો ઉપયોગ કરો.c SPACA6 એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર ડોમેન.4HB, હિન્જ અને Ig જેવા ડોમેન સ્ટ્રીપ ચાર્ટ અનુક્રમે નારંગી, લીલો અને વાદળી રંગના છે.સ્તરો સ્કેલ પર દોરવામાં આવતા નથી.
SPACA6 ના 4HB ડોમેનમાં ચાર મુખ્ય હેલિકોસ (હેલીસીસ 1–4)નો સમાવેશ થાય છે, જે હેલિકલ હેલિક્સ (ફિગ. 2a) ના રૂપમાં ગોઠવાયેલા હોય છે, જે એન્ટિસમાંતર અને સમાંતર ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ (ફિગ. 2b) વચ્ચે વૈકલ્પિક હોય છે.એક નાનો વધારાનો સિંગલ-ટર્ન હેલિક્સ (હેલિક્સ 1′) બંડલ પર કાટખૂણે નાખવામાં આવે છે, જે હેલિકોસ 1 અને 2 સાથે ત્રિકોણ બનાવે છે. આ ત્રિકોણ હેલિકસ 3 અને 4 (3 અને 4) ના પ્રમાણમાં ગાઢ પેકિંગના હેલિકલ-ટ્વિસ્ટેડ પેકિંગમાં સહેજ વિકૃત છે ( ફિગ. 2a).
4HB N-ટર્મિનલ સ્ટ્રીપ ચાર્ટ.b ચાર હેલિકોના બંડલનું ટોચનું દૃશ્ય, દરેક હેલિક્સ N-ટર્મિનસ પર ઘેરા વાદળી અને C-ટર્મિનસ પર ઘેરા લાલ રંગમાં પ્રકાશિત થાય છે.c 4HB માટે ટોપ-ડાઉન સર્પાકાર વ્હીલ ડાયાગ્રામ, જેમાં પ્રત્યેક અવશેષ સિંગલ-લેટર એમિનો એસિડ કોડ સાથે લેબલવાળા વર્તુળ તરીકે દર્શાવવામાં આવે છે;વ્હીલની ટોચ પર માત્ર ચાર એમિનો એસિડની સંખ્યા આપવામાં આવે છે.બિન-ધ્રુવીય અવશેષો પીળા રંગના હોય છે, ધ્રુવીય ચાર્જ વગરના અવશેષો રંગીન લીલા હોય છે, હકારાત્મક રીતે ચાર્જ કરેલા અવશેષો વાદળી રંગના હોય છે અને નકારાત્મક રીતે ચાર્જ કરેલા અવશેષો લાલ રંગના હોય છે.d 4HB ડોમેનના ત્રિકોણાકાર ચહેરા, નારંગીમાં 4HB અને લીલા રંગમાં હિન્જ્સ.બંને ઇન્સેટ્સ સળિયાના આકારના ડાયસલ્ફાઇડ બોન્ડ દર્શાવે છે.
4HB આંતરિક હાઇડ્રોફોબિક કોર પર કેન્દ્રિત છે જે મુખ્યત્વે એલિફેટિક અને સુગંધિત અવશેષોથી બનેલું છે (ફિગ. 2c).કોરમાં Cys41 અને Cys55 વચ્ચે એક ડાયસલ્ફાઇડ બોન્ડ હોય છે જે હેલિકોસ 1 અને 2 ને ઉપરના ત્રિકોણમાં એકસાથે જોડે છે (ફિગ. 2d).હેલિક્સ 1′ માં CXXC મોટિફ અને મિજાગરીના પ્રદેશમાં β-હેરપીનની ટોચ પર જોવા મળતા અન્ય CXXC મોટિફ વચ્ચે બે વધારાના ડિસલ્ફાઇડ બોન્ડ રચાયા હતા (ફિગ. 2d).અજ્ઞાત કાર્ય (Arg37) સાથે રૂઢિચુસ્ત આર્જિનિન અવશેષો 1′, 1 અને 2 દ્વારા રચાયેલા હોલો ત્રિકોણની અંદર સ્થિત છે. એલિફેટિક કાર્બન પરમાણુ Cβ, Cγ અને Cδ Arg37 હાઇડ્રોફોબિક કોર સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે, અને તેના ગ્વાનિડિન જૂથો ચક્રીય રીતે આગળ વધે છે. હેલીસીસ 1′ અને 1 વચ્ચે Thr32 બેકબોન અને બાજુની સાંકળ (ફિગ. S5a,b) વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા દ્વારા.Tyr34 બે નાની પોલાણ છોડીને પોલાણમાં વિસ્તરે છે જેના દ્વારા Arg37 દ્રાવક સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરી શકે છે.
આઇજી-જેવા β-સેન્ડવીચ ડોમેન્સ એ પ્રોટીનનું એક વિશાળ સુપરફેમિલી છે જે હાઇડ્રોફોબિક કોર 39 દ્વારા ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરતી બે અથવા વધુ મલ્ટી-સ્ટ્રેન્ડેડ એમ્ફીપેથિક β-શીટ્સની સામાન્ય વિશેષતા ધરાવે છે. SPACA6 ના C-ટર્મિનલ Ig-જેવા ડોમેન સમાન પેટર્ન ધરાવે છે. અને બે સ્તરો ધરાવે છે (ફિગ. S6a).શીટ 1 એ ચાર સેરની β-શીટ છે (સ્ટ્રેન્ડ્સ D, F, H, અને I) જ્યાં સેર F, H, અને I એક વિરોધી સમાંતર ગોઠવણી બનાવે છે અને I અને D સમાંતર ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે.કોષ્ટક 2 એ નાની એન્ટિ-સમાંતર ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ બીટા શીટ (સેર E અને G) છે.E સાંકળના C-ટર્મિનસ અને H સાંકળના કેન્દ્ર (Cys170-Cys226) (ફિગ. S6b) વચ્ચે આંતરિક ડિસલ્ફાઇડ બોન્ડ જોવા મળ્યું હતું.આ ડિસલ્ફાઇડ બોન્ડ ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન 40,41 ના β-સેન્ડવિચ ડોમેનમાંના ડાયસલ્ફાઇડ બોન્ડ સાથે સમાન છે.
ચાર-સ્ટ્રેન્ડ β-શીટ તેની સમગ્ર લંબાઈ સાથે ટ્વિસ્ટ કરે છે, અસમપ્રમાણ ધાર બનાવે છે જે આકાર અને ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક્સમાં ભિન્ન હોય છે.પાતળી ધાર એ સપાટ હાઇડ્રોફોબિક પર્યાવરણીય સપાટી છે જે SPACA6 (ફિગ. S6b,c) માં બાકીની અસમાન અને ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિકલી વિવિધ સપાટીઓની તુલનામાં અલગ છે.ખુલ્લા બેકબોન કાર્બોનિલ/એમિનો જૂથો અને ધ્રુવીય બાજુની સાંકળોનો એક પ્રભામંડળ હાઇડ્રોફોબિક સપાટી (ફિગ. S6c) ની આસપાસ છે.વિશાળ માર્જિન કેપ્ડ હેલિકલ સેગમેન્ટ દ્વારા આવરી લેવામાં આવે છે જે હાઇડ્રોફોબિક કોરના N-ટર્મિનલ ભાગને અવરોધે છે અને F ચેઇન બેકબોન (ફિગ. S6d) ના ખુલ્લા ધ્રુવીય જૂથ સાથે ત્રણ હાઇડ્રોજન બોન્ડ બનાવે છે.આ ધારનો સી-ટર્મિનલ ભાગ આંશિક રીતે ખુલ્લા હાઇડ્રોફોબિક કોર સાથે વિશાળ ખિસ્સા બનાવે છે.ડબલ આર્જિનિન અવશેષોના ત્રણ સેટ (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 અને Arg212-Arg214) અને કેન્દ્રીય હિસ્ટીડિન (His220) (આકૃતિ S6e)ને કારણે ખિસ્સા હકારાત્મક ચાર્જથી ઘેરાયેલા છે.
મિજાગરું ક્ષેત્ર એ હેલિકલ ડોમેન અને Ig-જેવા ડોમેન વચ્ચેનો એક ટૂંકો સેગમેન્ટ છે, જેમાં એક એન્ટિસમાંતર ત્રણ-સ્ટ્રેન્ડેડ β-સ્તર (સેર A, B અને C), એક નાનું 310 હેલિક્સ અને ઘણા લાંબા રેન્ડમ હેલિકલ સેગમેન્ટ્સનો સમાવેશ થાય છે.(ફિગ. S7).હિન્જ પ્રદેશમાં સહસંયોજક અને ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક સંપર્કોનું નેટવર્ક 4HB અને Ig-જેવા ડોમેન વચ્ચેના અભિગમને સ્થિર કરતું દેખાય છે.નેટવર્કને ત્રણ ભાગોમાં વિભાજિત કરી શકાય છે.પ્રથમ ભાગમાં બે CXXC મોટિફ્સ (27CXXC30 અને 139CXXC142)નો સમાવેશ થાય છે જે હિન્જમાં β-હેરપિન અને 4HB માં 1′ હેલિક્સ વચ્ચે ડાયસલ્ફાઇડ બોન્ડની જોડી બનાવે છે.બીજા ભાગમાં Ig-જેવા ડોમેન અને મિજાગરું વચ્ચે ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓનો સમાવેશ થાય છે.મિજાગરીમાં Glu132 એ Ig-જેવા ડોમેનમાં Arg233 અને હિન્જમાં Arg135 સાથે મીઠું પુલ બનાવે છે.ત્રીજા ભાગમાં Ig-જેવા ડોમેન અને મિજાગરું ક્ષેત્ર વચ્ચે સહસંયોજક બોન્ડનો સમાવેશ થાય છે.બે ડિસલ્ફાઇડ બોન્ડ્સ (Cys124-Cys147 અને Cys128-Cys153) હિન્જ લૂપને લિંકર સાથે જોડે છે જે Gln131 અને બેકબોન ફંક્શનલ ગ્રૂપ વચ્ચે ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયા દ્વારા સ્થિર થાય છે, જે પ્રથમ Ig-જેવા ડોમેનને ઍક્સેસ કરવાની મંજૂરી આપે છે.સાંકળ
SPACA6 એક્ટોડોમેનનું માળખું અને 4HB અને Ig-જેવા ડોમેન્સનાં વ્યક્તિગત માળખાંનો ઉપયોગ પ્રોટીન ડેટાબેસેસ 42 માં માળખાકીય રીતે સમાન રેકોર્ડ્સ શોધવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.અમે ઉચ્ચ ડાલી ઝેડ સ્કોર્સ, નાના પ્રમાણભૂત વિચલનો અને મોટા LALI સ્કોર્સ (બાદમાં માળખાકીય રીતે સમકક્ષ અવશેષોની સંખ્યા છે) સાથે મેચોને ઓળખી કાઢ્યા.જ્યારે સંપૂર્ણ એક્ટોડોમેઈન સર્ચ (ટેબલ S1) ની પ્રથમ 10 હિટનો સ્વીકાર્ય Z-સ્કોર >842 હતો, ત્યારે એકલા 4HB અથવા Ig-જેવા ડોમેનની શોધ દર્શાવે છે કે આમાંની મોટાભાગની હિટ્સ માત્ર β-સેન્ડવિચને અનુરૂપ છે.એક સર્વવ્યાપક ગણો ઘણા પ્રોટીનમાં જોવા મળે છે.ડાલીમાં ત્રણેય શોધોએ માત્ર એક જ પરિણામ આપ્યું: IZUMO1.
લાંબા સમયથી એવું સૂચવવામાં આવ્યું છે કે SPACA6 અને IZUMO1 માળખાકીય સમાનતાઓ 7,32,37 શેર કરે છે.જોકે આ બે ગેમેટ ફ્યુઝન-સંબંધિત પ્રોટીનના એક્ટોડોમેન્સ માત્ર 21% સિક્વન્સ આઇડેન્ટિટી (આકૃતિ S8a) વહેંચે છે, જટિલ પુરાવા, જેમાં સંરક્ષિત ડિસલ્ફાઇડ બોન્ડ પેટર્ન અને SPACA6 માં અનુમાનિત C-ટર્મિનલ Ig-જેવા ડોમેનનો સમાવેશ થાય છે, પ્રારંભિક પ્રયાસોને મંજૂરી આપે છે. નમૂના તરીકે IZUMO1 નો ઉપયોગ કરીને A એ SPACA6 માઉસનું હોમોલોજી મોડલ37.અમારી રચના આ આગાહીઓની પુષ્ટિ કરે છે અને સમાનતાની સાચી ડિગ્રી દર્શાવે છે.વાસ્તવમાં, SPACA6 અને IZUMO137,43,44 સ્ટ્રક્ચર્સ સમાન 4HB અને Ig-જેવા β-સેન્ડવિચ ડોમેન્સ સાથે સમાન બે-ડોમેન આર્કિટેક્ચર (ફિગ. S8b) ને હિન્જ પ્રદેશ (ફિગ. S8c) દ્વારા જોડાયેલા છે.
IZUMO1 અને SPACA6 4HB માં પરંપરાગત સર્પાકાર બંડલ્સથી સામાન્ય તફાવત છે.લાક્ષણિક 4HBs, જેમ કે એન્ડોસોમલ ફ્યુઝન 45,46 માં સામેલ SNARE પ્રોટીન સંકુલમાં જોવા મળે છે, સમાનરૂપે અંતરે હેલિકોસ કેન્દ્રીય અક્ષ 47 ની આસપાસ સતત વળાંક જાળવી રાખે છે. તેનાથી વિપરીત, IZUMO1 અને SPACA6 બંનેમાં હેલિકલ ડોમેન્સ વિકૃત હતા, ચલ વક્રતા સાથે. અસમાન પેકિંગ (આકૃતિ S8d).સંભવતઃ હેલિકોસ 1′, 1 અને 2 દ્વારા રચાયેલા ત્રિકોણને કારણે બનેલો ટ્વિસ્ટ, IZUMO1 અને SPACA6 માં જાળવી રાખવામાં આવે છે અને હેલિક્સ 1′ પર સમાન CXXC મોટિફ દ્વારા સ્થિર થાય છે.જો કે, SPACA6 (Cys41 અને Cys55 સહસંયોજક રીતે હેલિકોસ 1 અને 2 ને ઉપર સાથે જોડે છે) માં જોવા મળતો વધારાનો ડાઈસલ્ફાઈડ બોન્ડ ત્રિકોણના શિખર પર એક તીક્ષ્ણ શિખર બનાવે છે, જે SPACA6 ને IZUMO1 કરતા વધુ વળાંકવાળા બનાવે છે, વધુ ઉચ્ચારણ પોલાણ ત્રિકોણ સાથે.વધુમાં, IZUMO1 પાસે SPACA6 માં આ પોલાણની મધ્યમાં અવલોકન કરાયેલ Arg37 નો અભાવ છે.તેનાથી વિપરીત, IZUMO1 એલિફેટિક અને સુગંધિત અવશેષોનો વધુ લાક્ષણિક હાઇડ્રોફોબિક કોર ધરાવે છે.
IZUMO1 પાસે Ig જેવું ડોમેન છે જેમાં ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ અને ફાઇવ-સ્ટ્રેન્ડેડ β-શીટ43 છે.IZUMO1 માં વધારાની સ્ટ્રાન્ડ SPACA6 માં કોઇલને બદલે છે, જે સ્ટ્રાન્ડમાં બેકબોન હાઇડ્રોજન બોન્ડને મર્યાદિત કરવા માટે F સ્ટ્રાન્ડ સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે.સરખામણીનો એક રસપ્રદ મુદ્દો એ બે પ્રોટીનના Ig-જેવા ડોમેન્સનો અનુમાનિત સપાટી ચાર્જ છે.IZUMO1 સપાટી SPACA6 સપાટી કરતાં વધુ નકારાત્મક રીતે ચાર્જ થયેલ છે.એક વધારાનો ચાર્જ શુક્રાણુ પટલનો સામનો કરતા સી-ટર્મિનસની નજીક સ્થિત છે.SPACA6 માં, સમાન પ્રદેશો વધુ તટસ્થ અથવા હકારાત્મક રીતે ચાર્જ કરવામાં આવ્યા હતા (ફિગ. S8e).ઉદાહરણ તરીકે, IZUMO1 માં SPACA6 માં હાઇડ્રોફોબિક સપાટી (પાતળી કિનારીઓ) અને હકારાત્મક રીતે ચાર્જ થયેલ ખાડાઓ (વિશાળ કિનારીઓ) નેગેટિવ રીતે ચાર્જ કરવામાં આવે છે.
IZUMO1 અને SPACA6 વચ્ચેના સંબંધો અને ગૌણ માળખાના ઘટકો સારી રીતે સચવાયેલા હોવા છતાં, Ig-જેવા ડોમેન્સનું માળખાકીય સંરેખણ દર્શાવે છે કે બે ડોમેન્સ એકબીજાની તુલનામાં તેમના સામાન્ય અભિગમમાં અલગ છે (ફિગ. S9).IZUMO1 નું સર્પાકાર બંડલ β-સેન્ડવિચની આસપાસ વળેલું છે, જે કેન્દ્રીય ધરીથી લગભગ 50° પર અગાઉ વર્ણવેલ "બૂમરેંગ" આકાર બનાવે છે.તેનાથી વિપરીત, SPACA6 માં હેલિકલ બીમ લગભગ 10° વિરુદ્ધ દિશામાં નમેલું હતું.આ ઓરિએન્ટેશનમાં તફાવત સંભવતઃ મિજાગરાના પ્રદેશમાં તફાવતને કારણે છે.પ્રાથમિક ક્રમ સ્તરે, IZUMO1 અને SPACA6 સિસ્ટીન, ગ્લાયસીન અને એસ્પાર્ટિક એસિડ અવશેષોના અપવાદ સિવાય, હિન્જ પર થોડી ક્રમ સમાનતા ધરાવે છે.પરિણામે, હાઇડ્રોજન બોન્ડ અને ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક નેટવર્ક સંપૂર્ણપણે અલગ છે.β-શીટ સેકન્ડરી સ્ટ્રક્ચર એલિમેન્ટ્સ IZUMO1 અને SPACA6 દ્વારા વહેંચવામાં આવે છે, જોકે IZUMO1 માં સાંકળો ઘણી લાંબી છે અને 310 હેલિક્સ (હેલિક્સ 5) SPACA6 માટે અનન્ય છે.આ તફાવતો બે અન્યથા સમાન પ્રોટીન માટે વિવિધ ડોમેન ઓરિએન્ટેશનમાં પરિણમે છે.
અમારી ડાલી સર્વર શોધથી જાણવા મળ્યું કે SPACA6 અને IZUMO1 એ પ્રોટીન ડેટાબેઝમાં સંગ્રહિત માત્ર બે પ્રાયોગિક રીતે નિર્ધારિત માળખાં છે જે આ ચોક્કસ 4HB ફોલ્ડ (ટેબલ S1) ધરાવે છે.તાજેતરમાં જ, ડીપમાઇન્ડ (આલ્ફાબેટ/ગૂગલ) એ આલ્ફાફોલ્ડ વિકસાવ્યું છે, એક ન્યુરલ નેટવર્ક આધારિત સિસ્ટમ કે જે પ્રાથમિક ક્રમ 48 થી પ્રોટીનની 3D રચનાની ચોક્કસ આગાહી કરી શકે છે.અમે SPACA6 માળખું ઉકેલ્યાના થોડા સમય પછી, આલ્ફાફોલ્ડ ડેટાબેઝ બહાર પાડવામાં આવ્યો, જે માનવ પ્રોટીઓમ 48,49 માં તમામ પ્રોટીનના 98.5%ને આવરી લેતા અનુમાનિત માળખું મોડેલ પ્રદાન કરે છે.શોધ મોડેલ તરીકે અમારા ઉકેલાયેલા SPACA6 સ્ટ્રક્ચરનો ઉપયોગ કરીને, આલ્ફાફોલ્ડ માનવ પ્રોટીઓમમાં મોડેલ માટે માળખાકીય હોમોલોજી શોધે SPACA6 અને IZUMO1 સાથે સંભવિત માળખાકીય સમાનતા ધરાવતા ઉમેદવારોની ઓળખ કરી.SPACA6 (ફિગ. S10a)-ની આગાહી કરવામાં આલ્ફાફોલ્ડની અવિશ્વસનીય ચોકસાઈને જોતાં-ખાસ કરીને 1.1 Å rms એક્ટોડોમેન અમારા ઉકેલાયેલા માળખા (ફિગ. S10b)-ની સરખામણીમાં-અમે વિશ્વાસ રાખી શકીએ છીએ કે ઓળખાયેલ SPACA6 મેચો સચોટ હોવાની શક્યતા છે.
અગાઉ, PSI-BLAST એ ત્રણ અન્ય શુક્રાણુ-સંબંધિત પ્રોટીન સાથે IZUMO1 ક્લસ્ટરની શોધ કરી હતી: IZUMO2, IZUMO3 અને IZUMO450.આલ્ફાફોલ્ડે આગાહી કરી હતી કે આ IZUMO ફેમિલી પ્રોટીન 4HB ડોમેનમાં IZUMO1 (આકૃતિઓ 3a અને S11) જેવી જ ડાયસલ્ફાઇડ બોન્ડ પેટર્ન સાથે ફોલ્ડ થાય છે, જો કે તેમાં Ig જેવા ડોમેનનો અભાવ છે.એવું અનુમાન કરવામાં આવે છે કે IZUMO2 અને IZUMO3 એ IZUMO1 જેવા જ એકતરફી પટલ પ્રોટીન છે, જ્યારે IZUMO4 સ્ત્રાવિત હોવાનું જણાય છે.ગેમેટ ફ્યુઝનમાં IZUMO 2, 3 અને 4 પ્રોટીનનાં કાર્યો નક્કી કરવામાં આવ્યાં નથી.IZUMO3 શુક્રાણુના વિકાસ દરમિયાન એક્રોસોમ બાયોજેનેસિસમાં ભૂમિકા ભજવવા માટે જાણીતું છે51 અને IZUMO પ્રોટીન એક જટિલ50 રચતું જોવા મળ્યું છે.સસ્તન પ્રાણીઓ, સરિસૃપ અને ઉભયજીવીઓમાં IZUMO પ્રોટીનનું સંરક્ષણ સૂચવે છે કે તેમનું સંભવિત કાર્ય અન્ય જાણીતા ગેમેટ-ફ્યુઝન-સંબંધિત પ્રોટીન, જેમ કે DCST1/2, SOF1 અને FIMP સાથે સુસંગત છે.
IST સુપરફેમિલીના ડોમેન આર્કિટેક્ચરનો ડાયાગ્રામ, જેમાં 4HB, હિન્જ અને Ig જેવા ડોમેન્સ અનુક્રમે નારંગી, લીલા અને વાદળી રંગમાં પ્રકાશિત છે.IZUMO4 પાસે એક અનન્ય C-ટર્મિનલ પ્રદેશ છે જે કાળો દેખાય છે.પુષ્ટિ થયેલ અને પુટેટિવ ​​ડિસલ્ફાઇડ બોન્ડ અનુક્રમે ઘન અને ડોટેડ રેખાઓ દ્વારા બતાવવામાં આવે છે.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (આલ્ફાફોલ્ડ DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (આલ્ફાફોલ્ડ DB: AF-Q1ZYLF1-F1), અને AlphaFold DB: AF-Q1ZYLF8-F1 DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) પેનલ A જેવી જ રંગ શ્રેણીમાં પ્રદર્શિત થાય છે. ડિસલ્ફાઇડ બોન્ડ કિરમજી રંગમાં બતાવવામાં આવે છે.TMEM95, IZUMO2 અને IZUMO3 ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન હેલિકોસ બતાવવામાં આવ્યાં નથી.
IZUMO પ્રોટીનથી વિપરીત, અન્ય SPACA પ્રોટીન (એટલે ​​કે, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 અને SPACA9) SPACA6 (ફિગ. S12) થી માળખાકીય રીતે અલગ હોવાનું માનવામાં આવે છે.ફક્ત SPACA9 પાસે 4HB છે, પરંતુ તેની પાસે સમાન સમાંતર-વિરોધી-સમાંતર અભિગમ અથવા SPACA6 જેવા સમાન ડિસલ્ફાઇડ બોન્ડની અપેક્ષા નથી.ફક્ત SPACA1 પાસે સમાન Ig- જેવું ડોમેન છે.આલ્ફાફોલ્ડ આગાહી કરે છે કે SPACA3, SPACA4 અને SPACA5 SPACA6 કરતાં સંપૂર્ણપણે અલગ માળખું ધરાવે છે.રસપ્રદ વાત એ છે કે, SPACA4 એ ગર્ભાધાનમાં ભૂમિકા ભજવવા માટે પણ જાણીતું છે, પરંતુ SPACA6 કરતાં વધુ હદ સુધી, તેના બદલે શુક્રાણુ અને oocyte zona pellucida52 વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને સરળ બનાવે છે.
અમારી આલ્ફાફોલ્ડ શોધમાં IZUMO1 અને SPACA6 4HB, TMEM95 માટે બીજો મેળ મળ્યો.TMEM95, એક જ શુક્રાણુ-વિશિષ્ટ ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન પ્રોટીન, જ્યારે 32,33ને ઓછું કરવામાં આવે ત્યારે નર ઉંદરને બિનફળદ્રુપ બનાવે છે.TMEM95 નો અભાવ ધરાવતા સ્પર્મેટોઝોઆમાં સામાન્ય મોર્ફોલોજી, ગતિશીલતા અને ઝોન પેલુસિડામાં પ્રવેશવાની અને ઇંડા પટલ સાથે જોડવાની ક્ષમતા હતી, પરંતુ તે oocyte મેમ્બ્રેન સાથે જોડાઈ શકતી નથી.અગાઉના અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે TMEM95 IZUMO133 સાથે માળખાકીય સમાનતા ધરાવે છે.ખરેખર, આલ્ફાફોલ્ડ મોડેલે પુષ્ટિ કરી છે કે TMEM95 એ 4HB છે જે IZUMO1 અને SPACA6 જેવા CXXC મોટિફ્સની સમાન જોડી ધરાવે છે અને SPACA6 (ફિગ. 3a અને S11) માં જોવા મળતા હેલિકોસ 1 અને 2 વચ્ચેના સમાન વધારાના ડિસલ્ફાઇડ બોન્ડ છે.જોકે TMEM95 માં Ig-જેવા ડોમેનનો અભાવ છે, તે SPACA6 અને IZUMO1 હિન્જ પ્રદેશો (ફિગ. 3b) જેવી જ ડાયસલ્ફાઇડ બોન્ડ પેટર્ન ધરાવતો પ્રદેશ ધરાવે છે.આ હસ્તપ્રતના પ્રકાશન સમયે, પ્રીપ્રિન્ટ સર્વરે TMEM95 ની રચનાની જાણ કરી, જે AlphaFold53 પરિણામની પુષ્ટિ કરે છે.TMEM95 SPACA6 અને IZUMO1 જેવું જ છે અને ઉભયજીવીઓ (ફિગ. 4 અને S13) માં પહેલેથી જ ઉત્ક્રાંતિપૂર્વક સાચવેલ છે.
PSI-BLAST શોધે NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP અને SOF1 ડેટાબેસેસનો ઉપયોગ જીવનના વૃક્ષમાં આ સિક્વન્સની સ્થિતિ નક્કી કરવા માટે કર્યો હતો.શાખા બિંદુઓ વચ્ચેનું અંતર માપન માટે દર્શાવવામાં આવતું નથી.
SPACA6 અને IZUMO1 વચ્ચેની આઘાતજનક એકંદર માળખાકીય સમાનતા સૂચવે છે કે તેઓ TMEM95 અને IZUMO 2, 3 અને 4 પ્રોટીનનો સમાવેશ કરતી સંરક્ષિત માળખાકીય સુપરફેમિલીના સ્થાપક સભ્યો છે.જાણીતા સભ્યો: IZUMO1, SPACA6 અને TMEM95.કારણ કે માત્ર થોડા સભ્યો પાસે Ig-જેવા ડોમેન્સ છે, IST સુપરફેમિલીનું હોલમાર્ક 4HB ડોમેન છે, જે આ તમામ પ્રોટીન માટે સામાન્ય વિશિષ્ટ લક્ષણો ધરાવે છે: 1) એક વિરોધી સમાંતર/સમાંતર ફેરબદલ (ફિગ) માં ગોઠવાયેલા હેલિકો સાથે કોઇલ કરેલ 4HB . 5a), 2) બંડલમાં ત્રિકોણાકાર ચહેરો હોય છે જેમાં બંડલની અંદર બે હેલિકોસ હોય છે અને ત્રીજું વર્ટિકલ હેલિક્સ હોય છે (ફિગ. કી એરિયા (ફિગ. 5c). થિયોરેડોક્સિન જેવા પ્રોટીનમાં જોવા મળતું CXXC મોટિફ કાર્ય કરવા માટે જાણીતું છે. રેડોક્સ સેન્સર 54,55,56 તરીકે, જ્યારે IST પરિવારના સભ્યોમાં મોટિફને ગેમેટ ફ્યુઝનમાં ERp57 જેવા પ્રોટીન ડાયસલ્ફાઇડ આઇસોમેરેસિસ સાથે સાંકળી શકાય છે. ભૂમિકાઓ 57,58 સાથે સંકળાયેલી છે.
IST સુપરફેમિલીના સભ્યોને 4HB ડોમેનની ત્રણ લાક્ષણિક લાક્ષણિકતાઓ દ્વારા વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવે છે: સમાંતર અને એન્ટિસમાંતર ઓરિએન્ટેશન વચ્ચે વારાફરતી ચાર હેલિકોસ, બા-ત્રિકોણાકાર હેલિકલ બંડલ ફેસ, અને નાના અણુઓ વચ્ચે રચાયેલ ca CXXC ડબલ મોટિફ.) N-ટર્મિનલ હેલિક્સ (નારંગી) અને હિન્જ પ્રદેશ β-હેરપીન (લીલો).
SPACA6 અને IZUMO1 વચ્ચેની સમાનતાને જોતાં, IZUMO1 અથવા JUNO સાથે જોડવાની ભૂતપૂર્વની ક્ષમતાનું પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું.બાયોલેયર ઇન્ટરફેરોમેટ્રી (BLI) એ ગતિ-આધારિત બંધનકર્તા પદ્ધતિ છે જેનો ઉપયોગ અગાઉ IZUMO1 અને JUNO વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને માપવા માટે કરવામાં આવ્યો છે.IZUMO1 સાથે બાયોટિન-લેબલવાળા સેન્સરને JUNO વિશ્લેષકની ઉચ્ચ સાંદ્રતા સાથે બાઈટ તરીકે ઉકાળ્યા પછી, એક મજબૂત સંકેત મળી આવ્યો (ફિગ. S14a), જે સેન્સરની ટોચ સાથે જોડાયેલ બાયોમટીરિયલની જાડાઈમાં બંધનકર્તા-પ્રેરિત ફેરફાર સૂચવે છે.સમાન સંકેતો (એટલે ​​​​કે, IZUMO1 વિશ્લેષક સામે બાઈટ તરીકે સેન્સર સાથે જોડાયેલ JUNO) (ફિગ. S14b).જ્યારે SPACA6 નો ઉપયોગ સેન્સર-બાઉન્ડ IZUMO1 અથવા સેન્સર-બાઉન્ડ JUNO (આકૃતિ S14a,b) સામે વિશ્લેષક તરીકે કરવામાં આવ્યો ત્યારે કોઈ સિગ્નલ મળ્યું ન હતું.આ સિગ્નલની ગેરહાજરી સૂચવે છે કે SPACA6 નું એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર ડોમેન IZUMO1 અથવા JUNO ના એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર ડોમેન સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરતું નથી.
કારણ કે BLI એસે બાઈટ પ્રોટીન પર મુક્ત લાયસિન અવશેષોના બાયોટિનિલેશન પર આધારિત છે, જો લાઈસિન અવશેષો ક્રિયાપ્રતિક્રિયામાં સામેલ હોય તો આ ફેરફાર બંધનને અટકાવી શકે છે.વધુમાં, સેન્સર સંબંધિત બંધનકર્તાનું ઓરિએન્ટેશન સ્ટીરિક અવરોધો બનાવી શકે છે, તેથી રિકોમ્બિનન્ટ SPACA6, IZUMO1 અને JUNO એક્ટોડોમેન્સ પર પરંપરાગત પુલ-ડાઉન એસેસ પણ કરવામાં આવ્યા હતા.આ હોવા છતાં, SPACA6 એ હિઝ-ટેગ કરેલ IZUMO1 અથવા હિઝ-ટેગ કરેલ JUNO (ફિગ. S14c,d) સાથે પ્રક્ષેપિત થયો નથી, જે દર્શાવે છે કે BLI પ્રયોગોમાં અવલોકન કરાયેલ સાથે સુસંગત કોઈ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા નથી.સકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે, અમે JUNO ની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને તેની IZUMO1 (ફિગર્સ S14e અને S15) લેબલ સાથે પુષ્ટિ આપી છે.
SPACA6 અને IZUMO1 વચ્ચે માળખાકીય સમાનતા હોવા છતાં, SPACA6 ની JUNO ને બાંધવામાં અસમર્થતા આશ્ચર્યજનક નથી.માનવ IZUMO1 ની સપાટી પર 20 થી વધુ અવશેષો છે જે JUNO સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે, જેમાં ત્રણેય પ્રદેશોમાંના દરેક અવશેષોનો સમાવેશ થાય છે (જોકે તેમાંના મોટાભાગના હિન્જ પ્રદેશમાં સ્થિત છે) (ફિગ. S14f).આ અવશેષોમાંથી, માત્ર એક જ SPACA6 (Glu70) માં સંરક્ષિત છે.જ્યારે ઘણા અવશેષોના અવશેષોએ તેમના મૂળ બાયોકેમિકલ ગુણધર્મો જાળવી રાખ્યા હતા, ત્યારે IZUMO1 માં આવશ્યક Arg160 અવશેષ SPACA6 માં નકારાત્મક રીતે ચાર્જ કરેલ Asp148 દ્વારા બદલવામાં આવ્યું હતું;અગાઉના અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે IZUMO1 માં Arg160Glu પરિવર્તન JUNO43 સાથેના બંધનને લગભગ સંપૂર્ણપણે નાબૂદ કરે છે.વધુમાં, IZUMO1 અને SPACA6 વચ્ચેના ડોમેન ઓરિએન્ટેશનમાં તફાવતે SPACA6 (ફિગ. S14g) પર સમકક્ષ પ્રદેશની JUNO-બંધનકર્તા સાઇટના સપાટીના ક્ષેત્રમાં નોંધપાત્ર વધારો કર્યો છે.
ગેમેટ ફ્યુઝન માટે SPACA6 ની જાણીતી જરૂરિયાત અને IZUMO1 સાથે તેની સમાનતા હોવા છતાં, SPACA6 પાસે સમાન JUNO બંધનકર્તા કાર્ય હોય તેવું લાગતું નથી.તેથી, અમે ઉત્ક્રાંતિ જીવવિજ્ઞાન દ્વારા પૂરા પાડવામાં આવેલ મહત્વના પુરાવા સાથે અમારા માળખાકીય ડેટાને જોડવાનો પ્રયાસ કર્યો છે.SPACA6 હોમોલોગનું ક્રમ સંરેખણ સસ્તન પ્રાણીઓની બહારના સામાન્ય બંધારણનું સંરક્ષણ દર્શાવે છે.ઉદાહરણ તરીકે, સિસ્ટીન અવશેષો દૂરથી સંબંધિત ઉભયજીવીઓમાં પણ હાજર છે (ફિગ. 6a).ConSurf સર્વરનો ઉપયોગ કરીને, SPACA6 સપાટી પર 66 સિક્વન્સનો બહુવિધ અનુક્રમ ગોઠવણી રીટેન્શન ડેટા મેપ કરવામાં આવ્યો હતો.આ પ્રકારનું વિશ્લેષણ બતાવી શકે છે કે પ્રોટીન ઉત્ક્રાંતિ દરમિયાન કયા અવશેષોનું સંરક્ષણ કરવામાં આવ્યું છે અને તે સૂચવી શકે છે કે કયા સપાટીના પ્રદેશો કાર્યમાં ભૂમિકા ભજવે છે.
CLUSTAL OMEGA નો ઉપયોગ કરીને તૈયાર કરેલ 12 વિવિધ પ્રજાતિઓમાંથી SPACA6 એક્ટોડોમેન્સનું અનુક્રમ સંરેખણ.Consurf વિશ્લેષણ મુજબ, સૌથી વધુ રૂઢિચુસ્ત સ્થિતિઓ વાદળી રંગમાં ચિહ્નિત થયેલ છે.સિસ્ટીન અવશેષો લાલ રંગમાં પ્રકાશિત થાય છે.ડોમેન સીમાઓ અને ગૌણ માળખું તત્વો ગોઠવણીની ટોચ પર બતાવવામાં આવે છે, જ્યાં તીરો β-સ્ટ્રેન્ડ સૂચવે છે અને તરંગો હેલિકોસ સૂચવે છે.NCBI એક્સેસ આઇડેન્ટિફાયર જેમાં સિક્વન્સ હોય છે: માનવ (હોમો સેપિયન્સ, NP_001303901), મેન્ડ્રીલ (મેન્ડ્રીલસ લ્યુકોફેયસ, XP_011821277), કેપ્યુચિન મંકી (સેબસ મિમિક, XP_0173599, XP_017359901, ઘોડા, 201366, ઘોડા, 201360, 201366, કેપ્યુચિન) વ્હેલ (ઓર્સિનસ ઓર્કા3_23 XP_032_034) .), ઘેટાં (ઓવિસ મેષ, XP_014955560), હાથી (Loxodonta africana, XP_010585293), કૂતરો (Canis lupus familyis, XP_025277208), માઉસ (Mus musculus, NP_001155560), XP_001155563, XP_001555638, શ્વાન 611, XP_0318), પ્લેટિપસ, 8) , 61_89 અને બુલફ્રોગ (Bufo bufo, XP_040282113).ક્રમાંકન માનવ ક્રમ પર આધારિત છે.b ટોચ પર 4HB અને તળિયે Ig-જેવા ડોમેન સાથે SPACA6 સ્ટ્રક્ચરનું સપાટીનું પ્રતિનિધિત્વ, ConSurf સર્વરના સંરક્ષણ અંદાજ પર આધારિત રંગો.શ્રેષ્ઠ સાચવેલ ભાગો વાદળી રંગમાં છે, સાધારણ રીતે સાચવેલ ભાગો સફેદ રંગમાં છે અને સૌથી ઓછા સાચવેલ ભાગો પીળા રંગમાં છે.જાંબલી સિસ્ટીન.ઇન્સેટ લેબલવાળા પેચો 1, 2 અને 3 માં ઉચ્ચ સ્તરનું રક્ષણ દર્શાવતા ત્રણ સપાટી પેચો બતાવવામાં આવ્યા છે. એક 4HB કાર્ટૂન ઉપર જમણી બાજુના ઇનસેટમાં દર્શાવવામાં આવ્યું છે (સમાન રંગ યોજના).
SPACA6 માળખું ત્રણ અત્યંત સંરક્ષિત સપાટી વિસ્તારો ધરાવે છે (ફિગ. 6b).પેચ 1 4HB અને મિજાગરીના પ્રદેશને ફેલાવે છે અને તેમાં બે સંરક્ષિત CXXC ડિસલ્ફાઇડ બ્રિજ, એક Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 હિન્જ નેટવર્ક (ફિગ. S7), અને ત્રણ સંરક્ષિત બાહ્ય સુગંધિત અવશેષો (Phe31, Tyr137, Phe31) છે.Ig-જેવા ડોમેન (ફિગ. S6e) ની વિશાળ કિનાર, જે શુક્રાણુની સપાટી પર ઘણા હકારાત્મક રીતે ચાર્જ થયેલા અવશેષોનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.રસપ્રદ રીતે, આ પેચમાં એન્ટિબોડી એપિટોપ છે જે અગાઉ SPACA6 30 ફંક્શનમાં દખલ કરવા માટે દર્શાવવામાં આવ્યું છે.પ્રદેશ 3 હિન્જ અને Ig જેવા ડોમેનની એક બાજુને ફેલાવે છે;આ પ્રદેશમાં સંરક્ષિત પ્રોલાઇન્સ (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) અને બાહ્ય-મુખી ધ્રુવીય/ચાર્જ્ડ અવશેષો છે.આશ્ચર્યજનક રીતે, 4HB ની સપાટી પરના મોટાભાગના અવશેષો અત્યંત ચલ (ફિગ. 6b) છે, જો કે ફોલ્ડ સમગ્ર SPACA6 હોમોલોગ (હાઈડ્રોફોબિક બંડલ કોરના રૂઢિચુસ્તતા દ્વારા સૂચવ્યા મુજબ) અને IST સુપરફેમિલીથી આગળ સાચવેલ છે.
જો કે આ SPACA6 માં સૌથી ઓછા શોધી શકાય તેવા ગૌણ માળખાના ઘટકો સાથેનો સૌથી નાનો પ્રદેશ છે, ઘણા હિન્જ પ્રદેશના અવશેષો (વિસ્તાર 3 સહિત) SPACA6 હોમોલોગ્સમાં ખૂબ જ સંરક્ષિત છે, જે સૂચવી શકે છે કે હેલિકલ બંડલ અને β-સેન્ડવિચની દિશા ભૂમિકા ભજવે છે.રૂઢિચુસ્ત તરીકે.જો કે, SPACA6 અને IZUMO1 ના હિન્જ પ્રદેશમાં વ્યાપક હાઇડ્રોજન બંધન અને ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક નેટવર્ક્સ હોવા છતાં, IZUMO137,43,44 ના બહુવિધ મંજૂર માળખાના સંરેખણમાં આંતરિક સુગમતાના પુરાવા જોઈ શકાય છે.વ્યક્તિગત ડોમેન્સનું સંરેખણ સારી રીતે ઓવરલેપ થયું હતું, પરંતુ એકબીજાને સંબંધિત ડોમેન્સનું ઓરિએન્ટેશન કેન્દ્રીય અક્ષથી 50° થી 70° સુધી બદલાય છે (ફિગ. S16).ઉકેલમાં SPACA6 ની રચનાત્મક ગતિશીલતાને સમજવા માટે, SAXS પ્રયોગો કરવામાં આવ્યા હતા (ફિગ. S17a,b).SPACA6 એક્ટોડોમેઇનનું અબ ઇનિશિયો રીકન્સ્ટ્રક્શન રોડ ક્રિસ્ટલ સ્ટ્રક્ચર (ફિગ. S18) ને અનુરૂપ છે, જોકે ક્રેટકી પ્લોટ અમુક અંશે લવચીકતા દર્શાવે છે (ફિગ. S17b).આ રચના IZUMO1 સાથે વિરોધાભાસી છે, જેમાં અનબાઉન્ડ પ્રોટીન જાળી અને દ્રાવણ43 બંનેમાં બૂમરેંગ આકાર ધારણ કરે છે.
લવચીક પ્રદેશને ખાસ ઓળખવા માટે, હાઇડ્રોજન-ડ્યુટેરિયમ એક્સચેન્જ માસ સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી (H-DXMS) SPACA6 પર કરવામાં આવી હતી અને IZUMO143 (ફિગ. 7a,b) પર અગાઉ મેળવેલા ડેટા સાથે સરખામણી કરવામાં આવી હતી.SPACA6 સ્પષ્ટપણે IZUMO1 કરતાં વધુ લવચીક છે, જેમ કે 100,000 s વિનિમય પછી સમગ્ર માળખામાં ઉચ્ચ ડ્યુટેરિયમ વિનિમય દ્વારા પુરાવા મળે છે.બંને માળખામાં, હિન્જ પ્રદેશનો સી-ટર્મિનલ ભાગ ઉચ્ચ સ્તરનું વિનિમય દર્શાવે છે, જે સંભવતઃ 4HB અને Ig-જેવા ડોમેન્સ એકબીજાની તુલનામાં મર્યાદિત પરિભ્રમણને મંજૂરી આપે છે.રસપ્રદ રીતે, SPACA6 હિન્જનો C-ટર્મિનલ ભાગ, જેમાં 147CDLPLDCP154 અવશેષોનો સમાવેશ થાય છે, તે અત્યંત સંરક્ષિત પ્રદેશ 3 (ફિગ. 6b) છે, જે સંભવતઃ સૂચવે છે કે ઇન્ટરડોમેન લવચીકતા એ SPACA6 ની ઉત્ક્રાંતિપૂર્વક સંરક્ષિત વિશેષતા છે.લવચીકતા વિશ્લેષણ અનુસાર, CD થર્મલ મેલ્ટ ડેટા દર્શાવે છે કે SPACA6 (Tm = 51.2°C) IZUMO1 (Tm = 62.9°C) (ફિગ. S1e અને S19) કરતાં ઓછું સ્થિર છે.
SPACA6 અને b IZUMO1 ની H-DXMS છબીઓ.ટકાવારી ડ્યુટેરિયમ વિનિમય દર્શાવેલ સમય બિંદુઓ પર નિર્ધારિત કરવામાં આવ્યો હતો.હાઇડ્રોજન-ડ્યુટેરિયમ વિનિમયના સ્તરો વાદળી (10%) થી લાલ (90%) સુધીના ઢાળ સ્કેલ પર રંગ દ્વારા સૂચવવામાં આવે છે.બ્લેક બોક્સ ઉચ્ચ વિનિમયના ક્ષેત્રોનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.ક્રિસ્ટલ સ્ટ્રક્ચરમાં જોવામાં આવેલ 4HB, હિન્જ અને Ig-જેવા ડોમેનની સીમાઓ પ્રાથમિક ક્રમની ઉપર દર્શાવેલ છે.SPACA6 અને IZUMO1 ની પારદર્શક મોલેક્યુલર સપાટીઓ પર સ્ટ્રીપ ચાર્ટ પર 10 s, 1000 s અને 100,000 s પર ડ્યુટેરિયમ વિનિમય સ્તરો રચવામાં આવ્યા હતા.50% ની નીચે ડ્યુટેરિયમ વિનિમય સ્તર સાથેના માળખાના ભાગો રંગીન સફેદ હોય છે.50% H-DXMS એક્સચેન્જથી ઉપરના વિસ્તારો ગ્રેડિયન્ટ સ્કેલમાં રંગીન હોય છે.
CRISPR/Cas9 અને માઉસ જનીન નોકઆઉટ આનુવંશિક વ્યૂહરચનાનો ઉપયોગ શુક્રાણુ અને એગ બાઈન્ડિંગ અને ફ્યુઝન માટે મહત્વપૂર્ણ ઘણા પરિબળોની ઓળખ તરફ દોરી ગયો છે.IZUMO1-JUNO અને CD9 સ્ટ્રક્ચરની સારી રીતે લાક્ષણિકતાવાળી ક્રિયાપ્રતિક્રિયા સિવાય, ગેમેટ ફ્યુઝન સાથે સંકળાયેલ મોટાભાગના પ્રોટીન માળખાકીય અને કાર્યાત્મક રીતે ભેદી રહે છે.SPACA6 ની બાયોફિઝિકલ અને માળખાકીય લાક્ષણિકતા એ ગર્ભાધાન દરમિયાન સંલગ્નતા/ફ્યુઝન મોલેક્યુલર પઝલનો બીજો ભાગ છે.
SPACA6 અને IST સુપરફેમિલીના અન્ય સભ્યો સસ્તન પ્રાણીઓ તેમજ વ્યક્તિગત પક્ષીઓ, સરિસૃપ અને ઉભયજીવીઓમાં અત્યંત સંરક્ષિત હોવાનું જણાય છે;હકીકતમાં, એવું માનવામાં આવે છે કે ઝેબ્રાફિશ 59 માં ગર્ભાધાન માટે પણ SPACA6 જરૂરી છે. આ વિતરણ અન્ય જાણીતા ગેમેટ ફ્યુઝન-સંબંધિત પ્રોટીન જેમ કે DCST134, DCST234, FIMP31, અને SOF132 જેવું જ છે, જે સૂચવે છે કે આ પરિબળો HAP2-ઉણપ છે (પણ GCS1) પ્રોટીન તરીકે ઓળખાય છે જે ઘણા પ્રોટીસ્ટની ઉત્પ્રેરક પ્રવૃત્તિ માટે જવાબદાર છે., છોડ અને આર્થ્રોપોડ્સ.ફર્ટિલાઇઝ્ડ ફ્યુઝન પ્રોટીન્સ 60, 61. SPACA6 અને IZUMO1 વચ્ચે મજબૂત માળખાકીય સમાનતા હોવા છતાં, આ પ્રોટીનમાંથી કોઈપણ એકને એન્કોડ કરતા જનીનો નોકઆઉટ નર ઉંદરમાં વંધ્યત્વમાં પરિણમ્યો, જે દર્શાવે છે કે ગેમેટ ફ્યુઝનમાં તેમના કાર્યો ડુપ્લિકેટ નથી..વધુ વ્યાપક રીતે, ફ્યુઝનના સંલગ્ન તબક્કા માટે જરૂરી જાણીતા શુક્રાણુ પ્રોટીનમાંથી કોઈ પણ બિનજરૂરી નથી.
તે એક ખુલ્લો પ્રશ્ન રહે છે કે શું SPACA6 (અને IST સુપરફેમિલીના અન્ય સભ્યો) ઇન્ટરગેમેટિક જંકશનમાં ભાગ લે છે, મહત્વપૂર્ણ પ્રોટીનને ફ્યુઝન પોઈન્ટમાં ભરતી કરવા માટે ઈન્ટ્રાગેમેટિક નેટવર્ક બનાવે છે અથવા કદાચ પ્રપંચી ફ્યુસોજેન્સ તરીકે પણ કાર્ય કરે છે.HEK293T કોષોમાં કો-ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન અભ્યાસોએ સંપૂર્ણ લંબાઈ IZUMO1 અને SPACA632 વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા જાહેર કરી.જો કે, અમારા રિકોમ્બિનન્ટ એક્ટોડોમેન્સ વિટ્રોમાં ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરતા ન હતા, જે સૂચવે છે કે નોડા એટ અલમાં જોવા મળતી ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ.બંનેને રચનામાં કાઢી નાખવામાં આવ્યા હતા (IZUMO1 ની સાયટોપ્લાઝમિક પૂંછડીની નોંધ લો, જે ગર્ભાધાન62 માટે બિનજરૂરી હોવાનું દર્શાવવામાં આવ્યું છે).વૈકલ્પિક રીતે, IZUMO1 અને/અથવા SPACA6 ને ચોક્કસ બંધનકર્તા વાતાવરણની જરૂર પડી શકે છે જે આપણે વિટ્રોમાં પુનઃઉત્પાદિત કરતા નથી, જેમ કે શારીરિક રીતે ચોક્કસ રચનાઓ અથવા અન્ય પ્રોટીન ધરાવતા પરમાણુ સંકુલ (જાણે છે અથવા હજુ સુધી શોધાયેલ નથી).જોકે IZUMO1 એક્ટોડોમેઇન પેરીવિટેલલાઇન જગ્યામાં ઇંડા સાથે શુક્રાણુઓના જોડાણમાં મધ્યસ્થી હોવાનું માનવામાં આવે છે, SPACA6 એક્ટોડોમેનનો હેતુ અસ્પષ્ટ છે.
SPACA6 નું માળખું પ્રોટીન-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓમાં સામેલ હોઈ શકે તેવી કેટલીક સંરક્ષિત સપાટીઓ દર્શાવે છે.સીએક્સએક્સસી મોટિફ (ઉપર નિયુક્ત પેચ 1) ની તુરંત જ અડીને આવેલા હિન્જ પ્રદેશનો સંરક્ષિત ભાગ ઘણા બાહ્ય-સામના સુગંધિત અવશેષો ધરાવે છે જે ઘણીવાર બાયોમોલેક્યુલ્સ વચ્ચે હાઇડ્રોફોબિક અને π-સ્ટેકિંગ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ સાથે સંકળાયેલા હોય છે.Ig-જેવા ડોમેન (પ્રદેશ 2) ની વ્યાપક બાજુઓ અત્યંત સંરક્ષિત આર્ગ અને તેના અવશેષો સાથે હકારાત્મક રીતે ચાર્જ કરેલ ગ્રુવ બનાવે છે, અને આ પ્રદેશ સામે એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ અગાઉ ગેમેટ ફ્યુઝન 30 ને અવરોધિત કરવા માટે કરવામાં આવ્યો છે.એન્ટિબોડી રેખીય એપિટોપ 212RIRPAQLTHRGTFS225 ને ઓળખે છે, જેમાં છ આર્જિનિન અવશેષોમાંથી ત્રણ છે અને હિઝ220 અત્યંત સંરક્ષિત છે.તે સ્પષ્ટ નથી કે તકલીફ આ ચોક્કસ અવશેષોના અવરોધને કારણે છે કે સમગ્ર પ્રદેશમાં.β-સેન્ડવિચના સી-ટર્મિનસની નજીક આ ગેપનું સ્થાન પડોશી શુક્રાણુ પ્રોટીન સાથે સીઆઈએસ-પ્રતિક્રિયા સૂચવે છે, પરંતુ oocyte પ્રોટીન સાથે નહીં.વધુમાં, હિન્જની અંદર અત્યંત લવચીક પ્રોલાઇન-સમૃદ્ધ ગૂંચ (સાઇટ 3) ની જાળવણી એ પ્રોટીન-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાનું સ્થળ હોઈ શકે છે અથવા, સંભવતઃ, બે ડોમેન્સ વચ્ચેની લવચીકતાની જાળવણી સૂચવે છે.SPACA6 ની અજાણી ભૂમિકા માટે લિંગ મહત્વપૂર્ણ છે.ગેમેટ્સનું ફ્યુઝન.
SPACA6 માં Ig-જેવી β-સેન્ડવીચ સહિત ઇન્ટરસેલ્યુલર સંલગ્ન પ્રોટીનના ગુણધર્મો છે.ઘણા એડહેસિવ પ્રોટીન્સ (દા.ત., કેડરિન, ઇન્ટિગ્રિન્સ, એડહેસિન્સ અને IZUMO1) એક અથવા વધુ β-સેન્ડવિચ ડોમેન્સ ધરાવે છે જે કોષ પટલમાંથી પ્રોટીનને તેમના પર્યાવરણીય લક્ષ્યો સુધી વિસ્તરે છે63,64,65.SPACA6 ના Ig-જેવા ડોમેનમાં સામાન્ય રીતે સંલગ્નતા અને સુસંગતતાના β-સેન્ડવિચમાં જોવા મળે છે: β-સેન્ડવિચના છેડે સમાંતર સેરના ડબલટ્સ, જેને મિકેનિકલ ક્લેમ્પ્સ66 તરીકે ઓળખવામાં આવે છે.એવું માનવામાં આવે છે કે આ હેતુ શીયર ફોર્સ સામે પ્રતિકાર વધારે છે, જે ઇન્ટરસેલ્યુલર ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓમાં સામેલ પ્રોટીન માટે મૂલ્યવાન છે.જો કે, એડહેસિન્સ સાથે આ સમાનતા હોવા છતાં, હાલમાં એવા કોઈ પુરાવા નથી કે SPACA6 ઈંડાની સફેદી સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે.SPACA6 એક્ટોડોમેન JUNO સાથે જોડવામાં અસમર્થ છે, અને SPACA6- વ્યક્ત કરતા HEK293T કોષો, અહીં બતાવ્યા પ્રમાણે, ઝોન 32 નો અભાવ ધરાવતા oocytes સાથે ભાગ્યે જ સંપર્ક કરે છે.જો SPACA6 ઇન્ટરગેમેટિક બોન્ડ્સ સ્થાપિત કરે છે, તો આ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓમાં અનુવાદ પછીના ફેરફારોની જરૂર પડી શકે છે અથવા અન્ય શુક્રાણુ પ્રોટીન દ્વારા સ્થિર થઈ શકે છે.પછીની પૂર્વધારણાના સમર્થનમાં, IZUMO1-ઉણપવાળા શુક્રાણુઓ oocytes સાથે જોડાય છે, જે દર્શાવે છે કે IZUMO1 સિવાયના અણુઓ ગેમેટ એડહેસન સ્ટેપ 27માં સામેલ છે.
ઘણા વાયરલ, સેલ્યુલર અને ડેવલપમેન્ટલ ફ્યુઝન પ્રોટીનમાં એવા ગુણધર્મો હોય છે જે ફ્યુસોજેન્સ તરીકે તેમના કાર્યની આગાહી કરે છે.ઉદાહરણ તરીકે, વાયરલ ફ્યુઝન ગ્લાયકોપ્રોટીન્સ (વર્ગ I, II અને III) માં પ્રોટીનના અંતમાં હાઇડ્રોફોબિક ફ્યુઝન પેપ્ટાઇડ અથવા લૂપ હોય છે જે યજમાન પટલમાં દાખલ કરવામાં આવે છે.IZUMO143 નો હાઇડ્રોફિલિસિટી નકશો અને IST નું માળખું (નિર્ધારિત અને અનુમાનિત) સુપરફેમિલીમાં કોઈ દેખીતું હાઇડ્રોફોબિક ફ્યુઝન પેપ્ટાઇડ દર્શાવ્યું નથી.આમ, જો IST માં કોઈપણ પ્રોટીન સુપરફેમિલી ફ્યુસોજેન્સ તરીકે કાર્ય કરે છે, તો તેઓ અન્ય જાણીતા ઉદાહરણોથી અલગ રીતે આમ કરે છે.
નિષ્કર્ષમાં, ગેમેટ ફ્યુઝન સાથે સંકળાયેલા પ્રોટીનના IST સુપરફેમિલીના સભ્યોના કાર્યો એક અસ્પષ્ટ રહસ્ય રહે છે.અમારું વિશિષ્ટ SPACA6 રિકોમ્બિનન્ટ પરમાણુ અને તેનું ઉકેલાયેલ માળખું આ વહેંચાયેલ બંધારણો વચ્ચેના સંબંધો અને ગેમેટ જોડાણ અને ફ્યુઝનમાં તેમની ભૂમિકાની સમજ આપશે.
અનુમાનિત માનવ SPACA6 એક્ટોડોમેન (NCBI એક્સેસન નંબર NP_001303901.1; અવશેષો 27-246) ને અનુરૂપ ડીએનએ ક્રમ ડ્રોસોફિલા મેલાનોગાસ્ટર S2 કોષોમાં અભિવ્યક્તિ માટે કોડોન-ઓપ્ટિમાઇઝ કરવામાં આવ્યો હતો અને જીન્સ કોફિન ફ્રેગમેન્ટ સાથે કોફિન ફ્રેગમેન્ટ તરીકે સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યો હતો., BiP સ્ત્રાવ સિગ્નલ અને અનુરૂપ 5′ અને 3′ આ જનીનનું બંધન-સ્વતંત્ર ક્લોનિંગ માટે pMT અભિવ્યક્તિ વેક્ટરમાં સમાપ્ત થાય છે જે મેટાલોથિઓનિન પ્રમોટર પર આધારિત છે જે પ્યુરોમાસીન (pMT-પુરો) સાથે પસંદગી માટે સુધારેલ છે.પીએમટી-પુરો વેક્ટર થ્રોમ્બિન ક્લીવેજ સાઇટને એન્કોડ કરે છે અને ત્યારબાદ 10x-હિસ સી-ટર્મિનલ ટેગ (આકૃતિ S2) આવે છે.
SPACA6 pMT-puro વેક્ટરનું D. melanogaster S2 (Gibco) કોષોમાં સ્થિર ટ્રાન્સફેક્શન IZUMO1 અને JUNO43 માટે વપરાતા પ્રોટોકોલની જેમ જ કરવામાં આવ્યું હતું.S2 કોષો પીગળીને સ્નેડરના માધ્યમ (Gibco) માં ઉગાડવામાં આવ્યા હતા અને 10% (v/v) ઉષ્મા-નિષ્ક્રિય ગર્ભ વાછરડા સીરમ (Gibco) અને 1X એન્ટિમાયકોટિક એન્ટિબાયોટિક (Gibco) ની અંતિમ સાંદ્રતા સાથે પૂરક હતા.પ્રારંભિક પેસેજ કોષો (3.0 x 106 કોષો) 6-વેલ પ્લેટ્સ (કોર્નિંગ) ના વ્યક્તિગત કુવાઓમાં પ્લેટેડ હતા.27°C તાપમાને 24 કલાકના સેવન પછી, ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલ અનુસાર SPACA6 pMT-puro વેક્ટર અને Effectene Transfection Reagent (Qiagen)ના 2 મિલિગ્રામના મિશ્રણથી કોષોને ટ્રાન્સફેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા.ટ્રાન્સફેક્ટેડ કોષોને 72 કલાક માટે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા અને પછી 6 મિલિગ્રામ/એમએલ પ્યુરોમાસીન સાથે કાપણી કરવામાં આવી હતી.ત્યારબાદ કોષોને સંપૂર્ણ સ્નેઈડરના માધ્યમથી અલગ કરવામાં આવ્યા હતા અને મોટા પાયે પ્રોટીન ઉત્પાદન માટે સીરમ ફ્રી ઈન્સેક્ટ-એક્સપ્રેસ માધ્યમ (લોન્ઝા)માં મૂકવામાં આવ્યા હતા.S2 સેલ કલ્ચરનો 1 L બેચ 2 L વેન્ટિલેટેડ ફ્લેટ-બોટમવાળા પોલીપ્રોપીલિન એર્લેનમેયર ફ્લાસ્કમાં 8-10 × 106 ml-1 કોષો સુધી ઉગાડવામાં આવ્યો હતો અને પછી 500 µM CuSO4 (મિલિપોર સિગ્મા) અને જંતુરહિત ફિલ્ટરની અંતિમ સાંદ્રતા સાથે વંધ્યીકૃત કરવામાં આવ્યો હતો.પ્રેરિત.પ્રેરિત સંસ્કૃતિઓને 27° સે. પર 120 rpm પર ચાર દિવસ માટે ઉકાળવામાં આવી હતી.
SPACA6 ધરાવતા કન્ડિશન્ડ માધ્યમને 4°C પર 5660×g પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા અલગ કરવામાં આવ્યું હતું અને ત્યારબાદ 10 kDa MWCO મેમ્બ્રેન સાથે સેન્ટ્રામેટ ટેન્જેન્શિયલ ફ્લો ફિલ્ટરેશન સિસ્ટમ (પાલ કોર્પ) દ્વારા અલગ કરવામાં આવ્યું હતું.SPACA6 ધરાવતું કેન્દ્રિત માધ્યમ 2 મિલી Ni-NTA એગેરોઝ રેઝિન (કિયાજેન) કૉલમ પર લાગુ કરો.Ni-NTA રેઝિનને બફર A ના 10 કૉલમ વોલ્યુમ્સ (CV) વડે ધોવાઇ હતી અને પછી 50 mM ની અંતિમ ઇમિડાઝોલ સાંદ્રતા આપવા માટે બફર A નું 1 CV ઉમેરવામાં આવ્યું હતું.SPACA6 ને 500 mM ની અંતિમ સાંદ્રતા માટે ઇમિડાઝોલ સાથે પૂરક બફર A ના 10 મિલી સાથે એલ્યુટ કરવામાં આવ્યું હતું.ડાયાલિસિસ માટે ડાયાલિસિસ ટ્યુબિંગ (MWCO 12-14 kDa) માં ડાયાલિસિસ ટ્યુબિંગ (MWCO 12-14 kDa) વિ. 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 અને 150 mM NaCl (બફર B) વિ.) 48 કલાક માટે 4°C પર.પછી થ્રોમ્બિન-ક્લીવ્ડ SPACA6 ને મીઠાની સાંદ્રતા ઘટાડવા માટે ત્રણ ગણું પાતળું કરવામાં આવ્યું અને 10 mm Tris-HCl, pH 7.5 સાથે સંતુલિત 1 ml MonoS 5/50 GL કેશન એક્સચેન્જ કૉલમ (Cytiva/GE) પર લોડ કરવામાં આવ્યું.કેશન એક્સ્ચેન્જરને 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ના 3 CV સાથે ધોવામાં આવ્યું હતું, પછી SPACA6 10 mM Tris-HCl માં 0 થી 500 mM NaCl ના રેખીય ઢાળ સાથે, 25 CV માટે pH 7.5 સાથે ધોવાઇ ગયું હતું.આયન વિનિમય ક્રોમેટોગ્રાફી પછી, SPACA6 ને 1 મિલી સુધી કેન્દ્રિત કરવામાં આવ્યું હતું અને બફર B સાથે સંતુલિત ENrich SEC650 10 x 300 કૉલમ (BioRad) માંથી isocratically eluted કરવામાં આવ્યું હતું.16% SDS-polyacrylamide જેલ પર Coomassie-stained electrophoresis દ્વારા શુદ્ધતાને નિયંત્રિત કરવામાં આવી હતી.બીયર-લેમ્બર્ટ કાયદા અને સૈદ્ધાંતિક દાઢ લુપ્તતા ગુણાંકનો ઉપયોગ કરીને 280 એનએમ પર શોષકતા દ્વારા પ્રોટીન સાંદ્રતાનું પ્રમાણ નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું.
શુદ્ધ SPACA6 નું 10 mM સોડિયમ ફોસ્ફેટ, pH 7.4 અને 150 mM NaF સામે રાતોરાત ડાયલાઇઝ કરવામાં આવ્યું હતું અને CD સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી દ્વારા વિશ્લેષણ પહેલાં તેને 0.16 mg/mL કરવામાં આવ્યું હતું.185 થી 260 nm ની તરંગલંબાઇ સાથે CD નું સ્પેક્ટ્રલ સ્કેનિંગ 50 nm/min ના દરે 25°C પર 1 mm ઓપ્ટિકલ પાથ લંબાઈ (હેલ્મા) સાથે ક્વાર્ટઝ ક્યુવેટ્સનો ઉપયોગ કરીને Jasco J-1500 સ્પેક્ટ્રોપોલિમીટર પર એકત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું.સીડી સ્પેક્ટ્રાને બેઝલાઈન સુધારવામાં આવ્યા હતા, સરેરાશ 10 થી વધુ એક્વિઝિશન કરવામાં આવ્યા હતા, અને cm2/dmol ડિગ્રીમાં સરેરાશ શેષ લંબગોળતા (θMRE) માં રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યા હતા:
જ્યાં MW એ Da માં દરેક નમૂનાનું પરમાણુ વજન છે;N એ એમિનો એસિડની સંખ્યા છે;θ એ મિલિડિગ્રીમાં લંબગોળતા છે;d cm માં ઓપ્ટિકલ પાથની લંબાઈને અનુલક્ષે છે;એકમોમાં પ્રોટીનની સાંદ્રતા.